玉米根系蛋白磷酸酶基因ZmPP2C功能分析及遺傳轉化研究.pdf

1、ZmPP2C(AY621066)是本實驗室從玉米根系中分離的一個蛋白磷酸酶基因,其編碼區(qū)長度為873 bp,編碼含有290個氨基酸殘基的蛋白質。為了研究ZmPP2C功能,我們首先將ZmPP2C與GFP在洋蔥表皮內(nèi)融合表達,發(fā)現(xiàn)該基因是在核內(nèi)表達；然后又利用花序浸染法轉化擬南芥,通過基因組PCR、半定量RT-PCR以及Western blot分析證實,該基因已經(jīng)成功轉入擬南芥染色體中并在蛋白質水平上表達。我們對獲得的T3代轉基因擬南芥純合

2、體,在逆境脅迫處理下,進行種子萌發(fā)、根的伸長以及各種生理指標的測定。并將該基因成功轉化玉米。主要結果如下： 1.玉米中ZmPP2C基因與擬南芥等其他植物中的同源性比較 利用Invitrogen軟件包中的alignX軟件,對分別來自于所有擬南芥中蛋白磷酸酶,以及與擬南芥、玉米、大麥、水稻、苜蓿等已經(jīng)研究過的PP2C蛋白進行了分子聚類分析,分別構建了ZmPP2C蛋白的系統(tǒng)進化樹。進化樹分析表明,ZmPP2C與冰葉日中花植物中

3、的MPC9同源性較高。與擬南芥中PP2C類蛋白的F類同源性較高。 2.玉米ZmPP2C基因的表達分析 對玉米幼苗進行甘露醇模擬干旱和高鹽脅迫處理,提取根系總RNA進行Northern雜交,結果表明,干旱和高鹽脅迫均對ZmPP2C基因的表達影響不明顯,且表達水平隨著脅迫時間延長略微下降；而在逆境恢復階段,基因表達量又逐漸恢復到正常水平。 3.玉米ZmPP2C基因的亞細胞定位 構建表達載體pBI121-ZmP

4、P2C-GFP,將ZmPP2C-GFP在洋蔥表皮細胞內(nèi)融合蛋白表達。在洋蔥表皮細胞的細胞核上觀察到綠色熒光,表明ZmPP2C定位于細胞核。而在對照細胞中的細胞膜、細胞質和細胞核中都有表達。這與TMpred軟件對ZmPP2C跨膜結構分析一致。 4.轉ZmPP2C基因擬南芥的鑒定 構建表達載體pBI121-ZmPP2C,利用花絮浸染法轉化野生型擬南芥(Col-0)。通過半定量RT-PCR和Western blot方法,在轉錄

5、和蛋白質表達水平上鑒定了5株高表達的T3代轉化植株(L1～L5)。 5.過量表達ZmPP2C基因抑制擬南芥在脅迫下的萌發(fā)率和根的伸長 將轉基因植株和野生型擬南芥播種在含有不同濃度的氯化鈉和甘露醇的MS培養(yǎng)基上進行萌發(fā)試驗。7天后,過量表達ZmPP2C基因的擬南芥相對于野生型其萌發(fā)率和根的伸長都受到抑制。而在對照狀態(tài)下其萌發(fā)率和根的伸長沒有明顯差別。 6.轉ZmPP2C基因擬南芥在逆境脅迫條件下的生理變化

6、為了檢測轉ZmPP2C基因擬南芥在脅迫條件下的變化,我們測定了一系列和植物逆境脅迫有密切關系的生理指標,包括凈光合速率,游離脯氨酸的積累,MDA含量,膜透性以及失水速率等。結果表明,未處理的轉基因和野生型擬南芥的這些指標沒有明顯變化。但是脅迫處理后,不管是野生型還是轉基因植株凈光合速率都下降,但野生型擬南芥下降的更明顯；轉基因擬南芥中Pro積累的量遠遠低于野生型；而轉基因植株中MDA含量和失水速率均高于野生型。這些結果表明,過量表達Zm

7、PP2C基因降低了轉基因擬南芥對逆境脅迫的抗性。 7.逆境脅迫相關基因的RT-PCR分析 為了檢測鹽脅迫和干旱脅迫下轉基因和野生型擬南芥脅迫相關基因的表達情況,選取脅迫相關基因RD29A,RD29B,P5CS1,P5C82,ABI1和ABI2用于研究。結果表明,相對于野生型擬南芥,在高鹽或干旱脅迫12到24小時內(nèi),轉基因擬南芥中RD29A,RD29B,PSCS1,P5CS2表達量降低或較慢。在高鹽脅迫條件下,ABI1和A

8、BI2的表達量明顯降低。在干旱脅迫下,ABI1的表達量基本不變,而ABI2表達量明顯降低。 8.轉基因擬南芥植株降低了對ABA的敏感性 在對照培養(yǎng)基上,轉基因擬南芥和野生型擬南芥發(fā)芽率沒有明顯差別,幾乎都是100％萌發(fā),而在含有ABA的培養(yǎng)基上,轉基因擬南芥的萌發(fā)率明顯高于野生型,即轉基因擬南芥對ABA的敏感性降低,根的伸長也是如此。 9.過量表達ZmPP2C基因降低了轉基因玉米的抗旱性 構建表達載體pC