TPO受體激動劑治療原發(fā)免疫性血小板減少癥的相關(guān)研究.pdf

1、第一部分TPO受體激動劑治療原發(fā)免疫性血小板減少癥患者后細胞因子的改變
　　研究背景:
　　原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是以體液免疫和細胞免疫介導的血小板過度破壞和巨核細胞成熟障礙為主要特征的獲得性免疫性出血性疾病。近年來，越來越多的研究已經(jīng)證實T細胞異常在ITP的發(fā)病中起著重要的作用，其中輔助性T細胞不僅在抗血小板抗體產(chǎn)生過程中起作用而且能促進ITP患者抗

2、血小板T細胞的活性。ITP患者會表現(xiàn)出Th1和Th17細胞增強而Th2細胞減低并伴有CD4+CD25+Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細胞受損的極化趨勢。并且有研究報道ITP患者體內(nèi)細胞毒性T細胞介導的血小板破壞是增強的。但是具體的作用機制仍需進一步研究。
　　促血小板生成素作為最重要的刺激血小板生成的細胞因子，在ITP患者中表現(xiàn)出含量的相對不足，因此一系列TPO受體激動劑在ITP治療中得到了很好的發(fā)展。其中艾曲泊帕和羅米司亭已經(jīng)被美國食品

3、藥品管理局列入了ITP治療的常規(guī)二線用藥，而在我國重組人促血小板生成素(rhTPO)也已經(jīng)作為激素抵抗和復發(fā)ITP患者的推薦用藥得到了廣泛的應(yīng)用。TPO-RAs用藥后往往能很快見效，但是一旦停藥血小板又常常會降回到用藥前水平，因此其單藥治療常常難以獲得長期的不依賴藥物的緩解。
　　在各種自身免疫性疾病中細胞因子介導的免疫都發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者的免疫失衡與其細胞因子譜的異常息息相關(guān)。而大劑量地塞米松、脾切除、美羅華

4、等治療手段都被發(fā)現(xiàn)在疾病緩解的同時伴有細胞因子異常的糾正。盡管TPO-RAs用于ITP臨床治療已經(jīng)數(shù)年，但是對其治療過程中是否伴有細胞因子改變?nèi)匀徊磺宄?br>　　研究目的:
　　1.驗證TPO-RAs治療激素耐受/復發(fā)型ITP的療效和副作用
　　2.評價TPO-RAs對ITP患者細胞因子改變的影響，從而探尋其起效和作用機制
　　研究方法:
　　1.選取26例慢性激素抵抗/復發(fā)型ITP患者，均為單藥口服艾曲泊帕

5、或者皮下注射重組人血小板生成素（沈陽三生，特比奧）治療。其中艾曲泊帕為25mg每天一次，可根據(jù)血小板計數(shù)調(diào)節(jié)用藥劑量到50或75mg每天以維持血小板計數(shù)在≥50×109/L。特比奧則為每天皮下注射300U/Kg體重，可調(diào)節(jié)為隔天一次以保證血小板計數(shù)不超過100×109/L。用藥前檢測血常規(guī)及肝腎功。用藥過程中每周監(jiān)測血常規(guī)。另外選取15位健康志愿者作為對照組。
　　2.治療六周后再次檢測血常規(guī)和肝腎功。根據(jù)患者血小板計數(shù)來分析療效

6、。根據(jù)血小板計數(shù)和有無出血將患者分為完全有效組，有效組和無效組。
　　3.取ITP患者治療前和治療后血清，并抽取健康志愿者血清。用ELISA法分別檢測血清中IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-17A和TGF-β1含量，對治療前患者與健康志愿者，患者治療前后，以及有效組和無效組患者治療前后的細胞因子進行對比。
　　4.取患者治療前后以及健康志愿者的外周血，提取RNA，用實時定量PCR技術(shù)檢測IL-2，IFN-γ，IL-4，I

7、L-17A，TGF-β1以及RORγt的mRNA水平，分別對治療前患者與健康志愿者，患者治療前后，以及有效組和無效組患者治療前后的這些細胞因子mRNA表達水平進行對比。
　　研究結(jié)果:
　　1.本次實驗中26位患者TPO-RAs治療有效的有19位（有效率為73.08％），其中CR的有7位（占26.92％），治療無效的有7位為（占26.92％）。艾曲泊帕治療前兩周有兩位患者因血小板計數(shù)小于10×109/L而接受了血小板輸注。全

8、部患者在治療過程中均耐受良好。3位患者（2位是艾曲泊帕治療一位是特比奧治療）出現(xiàn)了一過性肝酶升高，但在保肝治療后恢復正常。4位出現(xiàn)頭疼，2位出現(xiàn)疲勞，2位出現(xiàn)惡心和腹瀉。
　　2.ITP患者治療前血漿中IL-2和IFN-γ水平明顯高于健康對照者，而IL-4和TGF-β1則明顯低于健康對照者，兩者之間IL-17水平無明顯差異。TPO-RAs治療后患者的IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-17A水平并沒有發(fā)生明顯的改變。但TGF-β

9、1水平卻明顯升高(P=0.008)。治療后TGF-β1水平與健康對照組無明顯差異。
　　3.治療前ITP患者IL-2，IFN-γ，IL-17A以及RORγt的mRNA水平明顯高于健康對照者，而IL-4和TGF-β1的mRNA水平則明顯低于健康對照者。同樣治療前后患者IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-17A以及RORγt的mRNA水平都沒有明顯改變。而TGF-β1的mRNA水平明顯升高(P=0.039)，與健康對照組無統(tǒng)計學差異

10、。
　　4.治療有效組和無效組IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-17A的水平和mRNA水平與治療前相比均無明顯改變。同樣，RORγt的mRNA水平在有效組和無效組治療前后也是沒有明顯改變。但治療有效組TGF-β1不管血清水平還是其mRNA水平均比治療前明顯升高（P＜0.05），而治療無效組TGF-β1則無明顯變化。
　　研究結(jié)論:
　　TPO-RAs能有效促進激素抵抗或復發(fā)的ITP患者血小板升高，并且副作用輕微，患

11、者耐受良好。但是單一TPO-RAs治療不能糾正患者細胞因子的改變，不能改善ITP患者向Th1型細胞因子偏移的免疫失衡狀況。僅能使TGF-β1水平升高。這對于知道臨床上TPO-RAs聯(lián)合用藥提供了一定的理論依據(jù)。
　　第二部分rhTPO治療妊娠合并原發(fā)免疫性血小板減少癥動物模型的研究
　　研究背景:
　　妊娠期血小板減少是指妊娠期血小板計數(shù)小于150×109/L，在妊娠期婦女中常見。其發(fā)生原因有很多，其中由ITP引起的妊

12、娠期血小板減少，約占妊娠期血小板減少的4.1％。ITP在孕婦中發(fā)病率為1/1000-1/10000，由于母體的IgG型抗血小板抗體可通過胎盤到達胎兒循環(huán)，妊娠合并ITP患者除了母體會有ITP常見臨床癥狀外，也會導致胎兒血小板減少及出血，隨著妊娠后期血小板漸進性的減低，妊娠合并ITP患者圍產(chǎn)期死亡率和早產(chǎn)發(fā)生率均明顯升高。
　　妊娠合并ITP的治療是很復雜的，要達到最佳效果需要產(chǎn)科、血液科及新生兒科醫(yī)師協(xié)作完成，其用藥治療選擇可參照

13、非妊娠ITP患者。每一種治療選擇均需考慮其對母親和胎兒的有效性及安全性，并選擇對母嬰損害最小的治療手段。目前對妊娠合并ITP患者的一線治療主要包括糖皮質(zhì)激素和靜脈丙種球蛋白(IVIG)等，對于一線治療無效或者副作用不能耐受的妊娠合并ITP患者，可選擇的治療手段非常有限。國內(nèi)一系列研究已證實重組人促血小板生成素(rhTPO)治療慢性ITP有很好的療效和較好的安全性。也已有報道rhTPO用于妊娠合并ITP治療效果顯著且對母體和胎兒無明顯毒副

14、作用，但是對rhTPO治療妊娠合并ITP的療效和安全性仍需要可靠的動物實驗支持。
　　研究目的:
　　1.建立妊娠合并ITP小鼠模型
　　2.利用小鼠模型研究rhTPO對于妊娠合并ITP治療的療效和安全性
　　3.利用妊娠合并ITP小鼠模型進一步驗證rhTPO治療對Treg和血清TGF-β1水平的影響。
　　研究方法:
　　1.建立妊娠合并ITP小鼠模型:C57適齡雌鼠與適齡雄鼠2:1合籠，每日晨8時

15、觀察陰栓或行陰道涂片，觀察到陰栓或陰道涂片見精子者定義為孕0天，于孕0天給予孕鼠腹腔注射抗血小板抗體，首次注射5mg/只，每48小時補注射一次5mg/只，定期測定血小板水平，并根據(jù)血小板計數(shù)水平適當增加抗體劑量。以建立被動型妊娠合并ITP小鼠模型。
　　2.妊娠合并ITP小鼠隨機分為4組，于孕0天采血測定初始血小板水平。后注射抗血小板抗體，于孕1天起分別每天皮下注射0.9％生理鹽水，150U/Kg體重rhTPO，1500U/Kg體

16、重rhTPO，15000U/Kg體重rhTPO各100ul，連續(xù)注射14天，每日觀察母鼠情況，直至妊娠終止。于孕1，3，7，10，14天及妊娠終止時取血測定血常規(guī)。，于妊娠終止時留取血清測定血清生化六項，于妊娠終止隨機取每組一半母鼠處死，留取骨髓，行骨髓涂片和網(wǎng)狀纖維染色。并取每組所生小鼠隨機選取16只測定出生小鼠血常規(guī)。剩余每組一半孕鼠仍與新生小鼠同籠觀察小鼠成活情況至少3周。
　　3.與妊娠終止隨機所取每組15只母鼠處死后，血

17、清利用ELISA法測定TGF-β1水平，分離外周血和脾臟，利用流式細胞術(shù)測定每組母鼠Treg情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.妊娠合并ITP小鼠模型血小板變化情況:注射抗血小板抗體后第一天，孕鼠血小板即降低到最低水平，隨著造模時間延長，孕鼠血小板會逐漸升高，到造模第10天，血小板水平仍顯著低于對照組孕鼠。可認為妊娠合并ITP小鼠模型可用。
　　2.四組小鼠一般情況，食欲，精神狀況等在給藥期間和停藥期間均無明顯變化。局部注

18、射部位未見紅腫，實驗期間8只孕鼠發(fā)生難產(chǎn)（3只NS組，2只低劑量組，1只中劑量組，2只高劑量組），有六只難產(chǎn)因發(fā)現(xiàn)及時未出現(xiàn)死亡。剩下兩只難產(chǎn)死亡，解剖后未見明顯內(nèi)臟出血情況，難產(chǎn)的發(fā)生與用藥之間無明顯相關(guān)性。
　　3.用藥組與生理鹽水組相比，小鼠血小板計數(shù)明顯升高，血小板增多程度隨rhTPO濃度增加而有所增加，但無統(tǒng)計學意義。
　　4.用藥組與生理鹽水組相比，血清生化檢測及骨髓纖維化未見明顯異常，胎鼠產(chǎn)出率及小鼠存活率均無

19、統(tǒng)計學差異。出生后觀察三周，四組均為發(fā)現(xiàn)子代小鼠成長異常。
　　5.用藥組與生理鹽水組相比，血清TGF-β1水平明顯升高，脾細胞中Treg比例明顯增加，但外周血中Treg未檢測到統(tǒng)計學差異。
　　研究結(jié)論:
　　妊娠合并ITP小鼠被動模型可在一定程度上模擬人抗血小板抗體介導的ITP，被動模型小鼠血小板降低未影響其分娩過程。rhTPO治療抗血小板抗體引起的妊娠合并ITP小鼠療效顯著，可較快使血小板數(shù)量增加，模擬臨床劑量連