鹽芥激活標(biāo)簽突變體庫的建立及過量表達(dá)YAP1對擬南芥耐鹽性的影響.pdf

1、山東師范大學(xué)博士學(xué)位論文鹽芥激活標(biāo)簽突變體庫的建立及過量表達(dá)YAP1對擬南芥耐鹽性的影響姓名：趙吉強(qiáng)申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：趙彥修張慧20081010山東師范大學(xué)博士學(xué)位論文氧化脅迫相關(guān)的基因的表達(dá)，在抗氧化脅迫反應(yīng)中起著重要的作用。但是YAPl基因在高等植物中異源表達(dá)及對其影響還未見報(bào)道，因此YAPl基因在擬南芥中過量表達(dá)，對研究細(xì)胞抗氧化脅迫能力及運(yùn)用基因工程手段有效地提高植物的抗逆性具有重要意義。本論文的主要目的是

2、建立耐鹽模式植物鹽芥的激活標(biāo)簽突變體庫，為發(fā)掘利用鹽芥的耐鹽基因，揭示鹽芥耐鹽的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)研究了酵母轉(zhuǎn)錄因子YAPl基因在擬南芥中過量表達(dá)的功能。主要結(jié)果如下：1鹽芥激活標(biāo)記突變體庫的建立以耐鹽模式植物鹽芥為實(shí)驗(yàn)材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花浸染法將激活標(biāo)記載體pSKl015導(dǎo)入鹽芥基因組，試圖建立一定規(guī)模的鹽芥激活標(biāo)記突變體庫。主要結(jié)果如下：(1)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花侵染法，利用激活標(biāo)記載體pSKl015對鹽芥進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，共獲

3、得轉(zhuǎn)化To代種子10009左右，通過除草劑篩選，共獲得抗性苗約2000株。(2)通過對所獲得的鹽芥除草劑抗性苗隨機(jī)取約800株進(jìn)行bar基因的PCR檢測，朝性率在85％以上，證明采用除草劑對轉(zhuǎn)化突變體進(jìn)行篩選是可行的。(3)通過對獲得的2000株激活標(biāo)記抗性苗，采用TAIL—PCR的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌TDNA插入鹽芥基因組側(cè)翼序列的擴(kuò)增，并進(jìn)行測序，得到側(cè)翼序列150余條，并進(jìn)行了相關(guān)的序列分析。本實(shí)驗(yàn)的目的是建立飽和的鹽芥激活標(biāo)記突變體庫

4、，但由于各種因素的限制，所獲得的體變體的數(shù)量還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，大規(guī)模的突變體庫還在構(gòu)建之中。利用TAIL—PCR進(jìn)行側(cè)翼序列的擴(kuò)增已獲得初步成功，只是對于PCR產(chǎn)物的測序方法還有待于進(jìn)一步完善。2、YAPl基因在擬南芥中的過量表達(dá)通過RTPCR的方法克隆到Y(jié)APl基因，并將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體pROKII中，導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，進(jìn)行植物遺傳轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)其在擬南芥中過量表達(dá)，在含30mg／L的卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選獲得純合轉(zhuǎn)基因株系，自交一代獲得足夠的