降鈣素對(duì)卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變的作用及機(jī)制.pdf

1、第一部分降鈣素對(duì)卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤退變的作用
　　目的：建立卵巢切除合并椎體融合大鼠模型并給予鮭魚降鈣素（ salmon Calcitonin, sCT）干預(yù)，在證實(shí)該模型誘發(fā)融合部位相鄰節(jié)段椎間盤退變的基礎(chǔ)上，初步探討降鈣素對(duì)該模型的椎體融合及椎間盤退變的影響。
　　方法：
　　50只雌性3月齡Sprague~Dawley（SD）大鼠分別接受雙側(cè)卵巢切除術(shù)（Ovariectomy，OVX，30只）或

2、假手術(shù)（Sham，20只），4周后兩組除各自保留10只作為對(duì)照組外，其余大鼠均接受 L4~5椎體融合術(shù)（ Posterolateral lumbar fusion，PLF），OVX+PLF組大鼠分別接受安慰劑（OVX+PLF+V）或皮下注射 sCT（OVX+PLF+sCT）治療（16 IU/kg隔日一次，共12周）。其余三組大鼠均接受Sham+V、OVX+V、PLF+V及 OVX+PLF+V組大鼠給予等體積的生理鹽水作為對(duì)照。脊柱融合后

3、12周，處死動(dòng)物并取出L3~6節(jié)段及其椎間盤。先采用手法評(píng)估及X線評(píng)估融合情況，再磨鉆分離雙側(cè)L4~5橫突間融合部位并分離L5~6椎間盤及相鄰椎體，進(jìn)行脫鈣、包埋、切片以及染色。對(duì) L5~6椎間盤進(jìn)行van Gieson染色觀察相鄰節(jié)段椎間盤退變情況并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。同時(shí)基于VG染色圖像測(cè)量對(duì)椎間盤高度、終板厚度及終板鈣化面積比等進(jìn)行測(cè)量和分析。
　　結(jié)果：
　　1融合情況評(píng)估
　　手法檢測(cè)結(jié)果：對(duì)接受 PLF手術(shù)的大

4、鼠（PLF+V、OVX+PLF+V和 OVX+PLF+sCT組）檢查發(fā)現(xiàn)棘突纏繞的鋼絲完整且固定良好。所有進(jìn)行PLF的大鼠均未檢測(cè)到融合節(jié)段的活動(dòng)。
　　X線攝片分析結(jié)果：與 PLF+V組和 OVX+PLF+sCT組比較， OVX+PLF+V組融合部位密度較低，融合進(jìn)程延遲。評(píng)分結(jié)果示：OVX+PLF+V組顯著低于PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　2椎間盤退變組織學(xué)觀察及相關(guān)定量參數(shù)分析
　　組織學(xué)觀察及評(píng)

5、分：Sham+V組脊索細(xì)胞及髓核細(xì)胞外基質(zhì)較豐富纖維環(huán)排列整齊，終板軟骨層較多。OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組髓核、纖維環(huán)和終板表現(xiàn)出均有退變表現(xiàn)，包括脊索細(xì)胞數(shù)量減少并被軟骨樣細(xì)胞取代，尾側(cè)髓核有粘液樣改變。纖維環(huán)與髓核邊界模糊，膠原丟失，排列紊亂。軟骨終板有不同程度鈣化。OVX+PLF+V組退變較OVX+V組和PLF+V組更明顯。組織學(xué)退變?cè)u(píng)分結(jié)果：OVX+V組、PLF+V組、 OVX+PLF+V組和OVX+PLF

6、+sCT組均顯著高于Sham+V組（P<0.05），OVX+PLF+V組顯著高于其余各組（P<0.05）。
　　椎間盤退變相關(guān)定量參數(shù)分析：OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+V組椎間盤高度明顯低于Sham+V組（P<0.05），而終板厚度和終板鈣化面積比率明顯高于Sham+V組（P<0.05）。然而，經(jīng)降鈣素干預(yù)12周后， OVX+PLF+sCT組大鼠椎間盤高度顯著高于OVX+PLF+V組（P<0.05），而終板厚度和終

7、板鈣化面積比率顯著低于OVX+PLF+V組（P<0.05）。
　　OVX+V組、PLF+V組和 OVX+PLF+V組椎間盤高度顯著低于Sham+V組，終板厚度和鈣化面積比顯著高于Sham+V組，OVX+PLF+V組椎間盤高度顯著低于其余各組，終板厚度和鈣化面積比顯著高于其余各組。OVX+PLF+sCT椎間盤高度顯著高于OVX+PLF+V組（P<0.05），終板厚度和鈣化面積比顯著低于OVX+PLF+V組（P<0.05）。
　

8、　結(jié)論：脊柱融合手術(shù)和雙側(cè)卵巢切除均可誘發(fā)大鼠椎間盤退變，接受兩種造模手術(shù)較單一造模退變更加嚴(yán)重，該模型可用于模擬人類絕經(jīng)后椎體融合術(shù)誘發(fā)的椎間盤退變，降鈣素早期皮下注射能夠延緩相鄰節(jié)段椎間盤退變。
　　第二部分降鈣素對(duì)卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤Col~I、Col~IIAggrecan、MMP~13和ADAMTS~4表達(dá)的影響
　　目的：通過(guò)分析椎間盤 Col~I、 Col~II、Aggrecan、MMP~13和A

9、DAMTS~4的表達(dá)及降鈣素對(duì)其表達(dá)的影響，探討卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎間盤基質(zhì)代謝的增齡性變化及降鈣素的作用。
　　方法：
　　50只雌性3月齡Sprague~Dawley（SD）大鼠分別接受雙側(cè)卵巢切除術(shù)（Ovariectomy，OVX，30只）或假手術(shù)（Sham，20只），4周后兩組除各自保留10只作為對(duì)照組外，其余大鼠均接受 L4~5椎體融合術(shù)（Posterolateral lumbar fusion，PLF

10、），OVX+PLF組大鼠分別接受安慰劑（OVX+PLF+V）或皮下注射sCT（OVX+PLF+sCT）治療（16 IU/kg隔日一次，共12周）。其余三組大鼠均接受Sham+V、OVX+V、PLF+V及 OVX+PLF+V組大鼠給予等體積的生理鹽水作為對(duì)照。脊柱融合后12周，處死動(dòng)物并取出L3~6節(jié)段及其椎間盤，分離L5~6椎間盤及相鄰椎體，進(jìn)行脫鈣、包埋、制備石蠟切片，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組L5~6椎間盤髓核和纖維環(huán)中Col~I、

11、 Col~II、Aggrecan、MMP~13和ADAMTS~4表達(dá)情況，應(yīng)用 Image pro~Plus6.0軟件對(duì)免疫組化陽(yáng)性蛋白表達(dá)情況進(jìn)行積分光密度(integrated optical density, IOD）計(jì)算，定量分析各組L5~6椎間盤中陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果示 Col~I、 Col~II、Aggrecan、MMP~13和ADAMTS~4在纖維環(huán)和髓核均有陽(yáng)性表達(dá)，著色淺

12、黃或棕黃色不等，具體表達(dá)情況如下：
　　Col~I：免疫組織化學(xué)染色及 IOD分析結(jié)果示 Col~I在髓核及纖維環(huán)中表達(dá)趨勢(shì)相同，Sham+V組表達(dá)水平最低，OVX+PLF+V組表達(dá)水平最高，兩兩比較結(jié)果：OVX+V組、 PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著高于Sham+V組，OVX+PLF+V組顯著高于OVX+V組、 PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　Col~II：免疫組織化學(xué)染色及IOD分析結(jié)果示Col~

13、II在髓核及纖維環(huán)中表達(dá)趨勢(shì)相同，Sham+V組表達(dá)水平最高，OVX+PLF+V組表達(dá)水平最低，兩兩比較結(jié)果：OVX+V組、 PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著低于Sham+V組，OVX+PLF+V組顯著低于OVX+V組、 PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　Aggrecan：免疫組織化學(xué)染色及 IOD分析結(jié)果示 Aggrecan在髓核及纖維環(huán)中表達(dá)趨勢(shì)相同，Sham+V組表達(dá)水平最高，OVX+PLF+V組表達(dá)水平

14、最低，兩兩比較結(jié)果：OVX+V組、PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著低于Sham+V組，OVX+PLF+V組顯著低于OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　MMP~13：免疫組織化學(xué)染色及 IOD分析結(jié)果示 MMP~13在髓核及纖維環(huán)中表達(dá)趨勢(shì)相同，Sham+V組表達(dá)水平最低，OVX+PLF+V組表達(dá)水平最高，兩兩比較結(jié)果：OVX+V組、PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著高于Sham+V組，OVX+

15、PLF+V組顯著高于OVX+V組、PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　ADAMTS~4：免疫組織化學(xué)染色及 IOD分析結(jié)果示 ADAMTS~4在髓核及纖維環(huán)中表達(dá)趨勢(shì)相同， Sham+V組表達(dá)水平最低， OVX+PLF+V組表達(dá)水平最高，兩兩比較結(jié)果：OVX+V組、PLF+V組和 OVX+PLF+V組顯著高于 Sham+V組，OVX+PLF+V組顯著高于OVX+V組、 PLF+V組和OVX+PLF+sCT組。
　　

16、結(jié)論：卵巢切除合并椎體融合大鼠相鄰節(jié)段椎間盤組織中Col~IIAggrecan等基質(zhì)成分丟失，椎間盤組織中 Col~I、MMP~13和ADAMTS~4水平升高，降鈣素干預(yù)可抑制這一進(jìn)程，提示降鈣素可通過(guò)調(diào)控基質(zhì)代謝抑制該模型椎間盤退變。
　　第三部分降鈣素對(duì)卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰節(jié)段椎體骨密度和微觀結(jié)構(gòu)的影響
　　目的：通過(guò)骨密度檢測(cè)及micro~CT分析探討降鈣素對(duì)卵巢切除大鼠脊柱融合后相鄰椎體骨骨量和微觀結(jié)構(gòu)的影響。

17、
　　方法：
　　50只雌性3月齡Sprague~Dawley（SD）大鼠分別接受雙側(cè)卵巢切除術(shù)（Ovariectomy，OVX，30只）或假手術(shù)（Sham，20只），4周后兩組除各自保留10只作為對(duì)照組外，其余大鼠均接受 L4~5椎體融合術(shù)（Posterolateral lumbar fusion，PLF），OVX+PLF組大鼠分別接受安慰劑（OVX+PLF+V）或皮下注射sCT（OVX+PLF+sCT）治療（16 IU/

18、kg，隔日一次，共12周）。其余三組大鼠均接受 Sham+V、OVX+VPLF+V及OVX+PLF+V組大鼠給予等體積的生理鹽水作為對(duì)照脊柱融合后12周，處死動(dòng)物并取出L3~L6節(jié)段及其椎間盤，經(jīng)雙能X線骨密度儀檢測(cè)L3~L6骨密度，Micro~CT分析L6椎體松質(zhì)骨微觀結(jié)構(gòu)，感興趣區(qū)為距離兩側(cè)生長(zhǎng)版1mm至4mm范圍松質(zhì)骨，直徑1.5mm的圓柱體，測(cè)算椎體骨小梁骨量及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，包括：骨密度、相對(duì)體積（ bone volume/trab

19、ecular volume, BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（Struc~ture Model Index, SMI）。
　　結(jié)果：
　　1 L3~L6骨密度：任意兩組間比較，L3~L6骨密度表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，OVX+V組和 OVX+PLF+V組骨密度分別顯著低于 Sham+V組和PLF+

20、V組（P<0.05），OVX+PLF+sCT組骨密度顯著高于OVX+PLF+V組（P<0.05）。
　　2 Micro~CT分析結(jié)果：骨密度、BV/TV, Tb.Th和Tb.N各組間比較結(jié)果趨勢(shì)相同：OVX+V組顯著低于Sham+V組（P<0.05）；OVX+PLF+V組顯著低于PLF+V和OVX+PLF+sCT組（P<0.05）。Tb.Sp和SMI各組間比較結(jié)果趨勢(shì)相同：OVX+V組顯著高于Sham+V組（P<0.05）；OVX