SIRT1基因?qū)ν俗冏甸g盤(pán)調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、椎間盤(pán)退變是一系列脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)，通常認(rèn)為它是一個(gè)與年齡相關(guān)多因素介導(dǎo)的綜合病理過(guò)程。目前臨床上對(duì)其干預(yù)手段及療效都十分有限，近年來(lái)通過(guò)外源性基因轉(zhuǎn)染椎間盤(pán)細(xì)胞延緩其退變進(jìn)程成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，其中SIRT1在一些年齡相關(guān)性疾病的研究中展現(xiàn)出了積極的療效。本項(xiàng)目擬從髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)生物學(xué)特性;白藜蘆醇對(duì)退變髓核細(xì)胞合成胞外基質(zhì)調(diào)控作用研究;SIRT1基因?qū)υ缙谕俗冏甸g盤(pán)胞外基質(zhì)與細(xì)胞凋亡調(diào)控作用及其機(jī)制研究三部分進(jìn)行闡述。

2、>　　 第一部分髓核細(xì)胞體外培養(yǎng)生物特性研究
　　 目的:對(duì)臨床椎間盤(pán)摘除術(shù)來(lái)源的髓核組織進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。
　　 方法:采用酶序貫消化法對(duì)髓核組織進(jìn)行分離，行單層原代細(xì)胞培養(yǎng)。采用大體形態(tài)觀察，細(xì)胞免疫組化法，細(xì)胞免疫熒光法，CD24流式細(xì)胞檢測(cè)等方法對(duì)髓核細(xì)胞進(jìn)行鑒定。取單層培養(yǎng)的第1、3、5、7代髓核細(xì)胞分別行形態(tài)學(xué)觀察，SA-β-gal染色觀察細(xì)胞衰老及甲苯胺藍(lán)染色觀察蛋白多糖表達(dá)。取同為第1代細(xì)胞分別進(jìn)行單層培養(yǎng)

3、和藻酸鹽立體培養(yǎng)，觀察其胞外基質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞增殖差異。
　　 結(jié)果:成功分離培養(yǎng)出原代髓核細(xì)胞，經(jīng)大體形態(tài)觀察，Ⅱ型膠原和aggrecan細(xì)胞免疫熒光，HIF-1α細(xì)胞免疫組化及CD24流式細(xì)胞檢測(cè)綜合判定所培養(yǎng)的細(xì)胞為髓核細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀測(cè)及SA-β-gal、甲苯胺藍(lán)染色示，在體外連續(xù)單層培養(yǎng)條件下髓核細(xì)胞容易改變自身表型，發(fā)生去分化現(xiàn)象，且隨著傳代次數(shù)的增加趨勢(shì)愈加明顯。藻酸鹽培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖速率低于單層培養(yǎng)，但胞外基質(zhì)col

4、lagenⅡ和aggrecan表達(dá)顯著提高。
　　 結(jié)論:酶序貫消化法可以成功培養(yǎng)出髓核細(xì)胞，單層培養(yǎng)過(guò)程中容易使髓核細(xì)胞失去固有表型，而藻酸微球培養(yǎng)環(huán)境有利于髓核細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下維持表型，維持胞外基質(zhì)的表達(dá)，為進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)的檢測(cè)打下基礎(chǔ)。
　　 第二部分白藜蘆醇對(duì)退變髓核細(xì)胞合成胞外基質(zhì)調(diào)控作用研究
　　 目的:研究SIRT1生物激動(dòng)劑RES對(duì)人退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞合成ECM的影響。
　　 方法:取腰

5、椎間盤(pán)突出癥患者術(shù)中摘除的髓核組織，對(duì)其進(jìn)行分離、體外藻酸鹽三維培養(yǎng)，采用不同濃度RES（50μmol/L和10μmol/L）和sirtinol（10μmol/L和1mol/L）分別刺激，PCR檢測(cè)對(duì)SIRT1、Ⅱ型膠原、aggrecan的mRNA表達(dá)。在10ng/ml IL-1β刺激下檢測(cè)50μmol/LRES與10μmol/L sirtinol對(duì)相關(guān)代謝酶MMP-2、13，ADAMTS-5，TIMP-1的mRNA表達(dá)影響。
　

6、　 結(jié)果:白藜蘆醇處理后，無(wú)論是RT-PCR還是qRT-PCR均顯示SIRT1、Ⅱ型膠原、aggrecan的mRNA表達(dá)水平增高，qRT-PCR示RES亦明顯抑制了IL-1β所誘導(dǎo)的MMP-2、13，ADAMTS-5的增高，TIMP-1的mRNA表達(dá)在與對(duì)照組的比較中顯著升高，sirtinol組觀測(cè)結(jié)果剛好相反。
　　 結(jié)論:RES可刺激退變髓核細(xì)胞ECM的合成，可以抑制IL-1β介導(dǎo)的對(duì)ECM的降解作用，這種調(diào)節(jié)作用與SIR

7、T1的活性有關(guān)。
　　 第三部分SIRT1基因?qū)υ缙谕俗兯韬思?xì)胞胞外基質(zhì)與細(xì)胞凋亡調(diào)控作用及其機(jī)制研究
　　 目的:研究SIRT1對(duì)早期退變椎間盤(pán)髓核細(xì)胞ECM和細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法:取腰椎間盤(pán)突出癥患者手術(shù)來(lái)源的髓核組織，運(yùn)用磁共振，免疫組化，TUNEL染色，P53、P21蛋白測(cè)定以及甲苯胺藍(lán)染色等方式初步探討SIRT1與ECM和細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。對(duì)年輕組的髓核細(xì)胞行體外藻酸鹽三維培養(yǎng)，運(yùn)用SIR

8、T1-siRNA和慢病毒介導(dǎo)的SIRT1過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染髓核細(xì)胞，靶向調(diào)控SIRT1的沉默和過(guò)表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)ECM合成影響，加入10ng/ml IL-1β刺激后，western blot，DMMB法，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)SIRT1受到靶向調(diào)控后對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡的影響。Western blot檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)P65和乙?；疨65蛋白表達(dá)的影響，免疫共沉淀檢測(cè)SIRT1與P65之間是否存在相互作用，細(xì)胞免疫熒光觀察SI

9、RT1對(duì)P65核內(nèi)遷徙的影響。
　　 結(jié)果:老年組SIRT1的表達(dá)明顯低于年輕組，而細(xì)胞凋亡率和合成ECM的能力亦明顯低于年輕組。SIRT1表達(dá)被siRNA靶向沉默后，白藜蘆醇對(duì)ECM的促進(jìn)作用明顯減弱。慢病毒轉(zhuǎn)染成功后，SIRT1表達(dá)增高，酶的活性亦隨之增高，但western blot檢測(cè)COL2A1和aggrecan的蛋白表達(dá)并沒(méi)有明顯差異，DMMB法測(cè)GAG表達(dá)與對(duì)照組相比也未見(jiàn)明顯差異。但SIRT1過(guò)表達(dá)后對(duì)IL-1β介