阿侖膦酸鈉對卵巢切除大鼠腰椎間盤退變的作用及其機制的研究.pdf

1、腰椎間盤退變是導致下腰部疼痛的主要病因之一，下腰痛給患者帶來巨大痛苦的同時，給家庭及社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。一些臨床及流行病學研究認為，骨質(zhì)疏松與脊柱退行性疾病或椎間盤退變呈負相關(guān)性，但最近的一項關(guān)于絕經(jīng)期前后婦女椎體骨密度與腰椎間盤退變相關(guān)性的研究顯示，腰椎骨密度與腰椎間盤退變呈正相關(guān)性，跟骨及橈骨的骨密度同樣與椎間盤退變密切相關(guān)。此外，在前期研究中發(fā)現(xiàn)卵巢切除大鼠腰椎間盤退變與椎體骨量丟失密切相關(guān)，提示對骨質(zhì)疏松的治療可能會對椎間盤

2、退變進程發(fā)揮一定的作用。骨質(zhì)疏松與椎間盤退變關(guān)系仍存在爭議，因此兩者之間的關(guān)系還有待進一步研究。
　　 研究顯示，椎間盤退變與脊柱結(jié)構(gòu)完整有關(guān)，包括鄰近的結(jié)構(gòu)如椎體及終板。椎體及終板結(jié)構(gòu)的破壞將導致異常力學負荷作用于椎間盤。對絕經(jīng)期前后婦女骨密度變化的研究結(jié)果顯示，骨密度與椎間盤的高度存在一定的相關(guān)性，說明椎體的結(jié)構(gòu)特性與椎間盤退變程度密切相關(guān)，并且組織結(jié)構(gòu)的改變同樣會影響到其它結(jié)構(gòu)進而出現(xiàn)改變。骨密度降低所引起的椎體骨折可導致

3、椎間盤高度降低，并加速椎間盤的退變進程。軟骨終板不僅是維持椎間盤正常功能的重要結(jié)構(gòu)，同時還是髓核獲取營養(yǎng)的重要途徑。Nachemson等人發(fā)現(xiàn)，軟骨終板鈣化會導致軟骨終板增厚，軟骨終板內(nèi)軟骨層變薄，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)通過軟骨終板向椎間盤的擴散，最終導致椎間盤早期出現(xiàn)退行性變。
　　 雌激素缺乏可引起絕經(jīng)后婦女終板出現(xiàn)退行性改變，進而最終導致椎間盤發(fā)生退行性變。雌激素替代治療被建議用于骨質(zhì)疏松相關(guān)的椎間盤退變的治療。然而，患者因雌激

4、素治療尚存在一些不良反應而拒絕用藥，因此，當前迫切需要一種新的藥物用于骨質(zhì)疏松相關(guān)的椎間盤退變的治療，如二膦酸鹽類藥物:阿侖膦酸鈉、唑來膦酸鈉等。阿侖膦酸鈉作為一種潛在的二膦酸鹽類藥物，已廣泛用于絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的治療。阿侖膦酸鈉可提高患者骨密度，抑制骨轉(zhuǎn)換率，降低骨折發(fā)生率。最近，Neogi等人的研究顯示，阿侖膦酸鈉可以抑制絕經(jīng)后婦女椎間隙變窄，提示二膦酸鹽類藥物對椎間盤退變具有一定作用。阿侖膦酸鈉對椎間盤退變的作用機制尚不清楚，因

5、此本研究擬通過影像學、組織形態(tài)計量學、分子生物學等方法，探討阿侖膦酸鈉對卵巢切除大鼠腰椎間盤退變的作用及其相關(guān)作用機制，為臨床治療骨質(zhì)疏松相關(guān)的腰椎間盤退變提供理論依據(jù)及臨床用藥指導。
　　 第一部分卵巢切除大鼠椎體骨量丟失與腰椎間盤退變關(guān)系的實驗研究
　　 目的:探討卵巢切除大鼠椎體骨量丟失與大鼠腰椎間盤退變的關(guān)系。
　　 方法:20只3月齡雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠隨機分為兩組:假手術(shù)組（S

6、ham）及卵巢切除組(OVX)。Sham組大鼠進行假手術(shù)，僅暴露卵巢組織但不切除。OVX組大鼠經(jīng)卵巢切除術(shù)切除雙側(cè)卵巢組織，卵巢切除術(shù)后6個月，采用過量失血方法處死各組大鼠并收集L3-6節(jié)段及其椎間盤組織。椎體骨密度檢測及椎體骨組織形態(tài)計量學檢測用以評價大鼠椎體骨量及椎體微觀結(jié)構(gòu)的變化。對椎間盤進行van Gieson染色進行椎間盤組織學觀察并進行組織學評分。
　　 結(jié)果:
　　 1、骨密度檢測結(jié)果
　　 OVX

7、組大鼠L3-6椎體BMD顯著低于Sham組（P＜0.05）。
　　 2、椎體骨組織形態(tài)計量學檢測結(jié)果
　　 OVX組大鼠L4椎體骨小梁相對體積(BV/TV)，骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁數(shù)量(Tb.N)顯著低于Sham組（P＜0.05），而骨小梁分離度(Tb.Sp)，熒光周長百分率(％L.Pm)，礦化沉積率(MAR)及骨形成率（BFR/BV）顯著高于Sham組（P＜0.05）。
　　 3、組織形態(tài)學觀察及組織

8、學評分結(jié)果
　　 OVX組大鼠椎間盤髓核內(nèi)脊索細胞大量減少，軟骨樣細胞大量增殖，并可見粘液樣變性。軟骨終板可見大量骨樣組織及髓腔生成。OVX組椎間盤組織學評分顯著高于Sham組（P＜0.05）。
　　 第二部分阿侖膦酸鈉對卵巢切除大鼠腰椎間盤退變的預防作用的實驗研究
　　 目的:本研究旨在應用骨質(zhì)疏松大鼠模型探討預防性應用阿侖膦酸鈉對腰椎間盤退變的作用。
　　 方法:30只3月齡雌性Sprague-Daw

9、ley(SD)大鼠隨機等分為三組:
　　 (1)假手術(shù)組(Sham);
　　 (2)卵巢切除+鹽水組(OVX+V);
　　 (3)卵巢切除+阿侖膦酸鈉組(OVX+ALN)。
　　 Sham組大鼠進行假手術(shù)，僅暴露卵巢組織但不切除。OVX+V組及OVX+ALN組大鼠經(jīng)卵巢切除術(shù)切除雙側(cè)卵巢組織后，OVX+ALN組大鼠給予阿侖膦酸鈉頸后皮下注射，劑量為15μg/kg，一周兩次。OVX+V組大鼠給予等體積的生理

10、鹽水作為對照。卵巢切除術(shù)后6個月，采用過量失血方法處死各組大鼠并收集L3-6節(jié)段椎體及其間盤組織。椎體骨密度檢測、micro-CT檢測及椎體生物力學檢測用以評價大鼠腰椎椎體骨組織特性及微觀結(jié)構(gòu)的變化。對椎間盤進行van Gieson染色進行椎間盤組織學觀察并進行組織學評分。同時對各組大鼠椎間盤高度以及軟骨終板厚度的變化進行分析比較。免疫組織化學染色及real-time PCR用于檢測各組大鼠椎間盤中aggrecan、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、

11、MMP-1、MMP-3及MMP-13表達的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、椎體骨密度檢測結(jié)果
　　 OVX+V組大鼠L3-4及L5-6椎體BMD顯著低于Sham組(P＜0.05)。OVX+ALN組大鼠L3-4及L5-6椎體BMD顯著高于OVX+V組（P＜0.05）
　　 2、Micro-CT檢測結(jié)果
　　 OVX+V組BV/TV、Tb.N顯著低于Sham組，而Tb.Sp及SMI顯著高于Sham組（

12、P＜0.05）。OVX+ALN組椎體BV/TV、Tb.N顯著高于OVX+V組，Tb.Sp及SMI顯著低于OVX+V組（P＜0.05）。而Tb.Th在三組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　 3、椎體生物力學檢測結(jié)果
　　 OVX+V組椎體極限負荷(maximum load)，屈服應力(yield stress)，極限應力(maximum stress)及彈性模量(elastic modulus)均顯著性低于Sham組(

13、P＜0.05)。OVX+ALN組椎體極限負荷，屈服應力，極限應力及彈性模量均顯著高于OVX+V組（P＜0.05）。
　　 4、組織形態(tài)學觀察及組織學評分結(jié)果
　　 OVX+V組椎間盤退變明顯，而OVX+ALN組椎間盤髓核內(nèi)僅出現(xiàn)少量的軟骨樣細胞，髓核未見粘液樣變性，在纖維環(huán)與髓核交接處可見纖維軟骨增殖現(xiàn)象。軟骨終板內(nèi)可見大量異常骨樣組織及髓腔生成。而OVX+ALN組椎間盤退變程度較輕，僅在髓核內(nèi)出現(xiàn)少量的軟骨樣細胞增殖，

14、以及在髓核與纖維環(huán)交界處出現(xiàn)一些軟骨細胞增殖，髓核內(nèi)未出現(xiàn)粘液樣變性。并且在軟骨終板中段未發(fā)現(xiàn)有異常骨樣組織生成。OVX+V組L5-6椎間盤組織學評分顯著高于Sham組，而OVX+ALN組組織學評分顯著低于OVX+V組(P＜0.05)。
　　 5、椎間盤高度檢測結(jié)果
　　 OVX+V組L5-6椎間盤高度顯著低于Sham組(P＜0.05)，OVX+ALN組L5-6椎間盤高度顯著高于OVX+V組（P＜0.05），OVX+AL

15、N組與Sham組L5-6椎間盤高度無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 6、軟骨終板厚度及軟骨終板內(nèi)骨樣組織面積檢測結(jié)果
　　 OVX+V組軟骨終板厚度及軟骨終板內(nèi)骨樣組織與軟骨終板面積比值均顯著高于Sham組(P＜0.05)，OVX+ALN組大鼠軟骨終板厚度顯著低于OVX+V組（P＜0.05），且軟骨終板內(nèi)骨樣組織與軟骨終板面積比值顯著低于OVX+V組(P＜0.05)。
　　 7、椎間盤免疫組織化學檢測結(jié)果

16、r>　　 OVX+V組髓核內(nèi)，aggrecan及Ⅱ型膠原染色強度顯著低于Sham組。然而，OVX+ALN組aggrecan及Ⅱ型膠原染色強度顯著高于OVX+V組。OVX+V組髓核內(nèi)MMP-1、MMP-3及MMP-13染色強度顯著高于Sham組，而OVX+ALN組髓核內(nèi)MMP-1、MMP-3及MMP-13染色強度顯著低于OVX+V組。
　　 OVX+V組纖維環(huán)中MMP-1、MMP-3及MMP-13表達增高，其IOD值顯著高于Sh

17、am組（P＜0.05）。但OVX+ALN組纖維環(huán)中MMP-1、MMP-3和MMP-13的表達顯著降低，其IOD值顯著低于OVX+V組（P＜0.05）。
　　 OVX+V組纖維環(huán)中Ⅰ型膠原表達增高及Ⅱ型膠原表達降低，其IOD值顯著高于或低于Sham組（P＜0.05）。而OVX+ALN組纖維環(huán)中Ⅰ型膠原表達降低及Ⅱ型膠原表達增強，其IOD值顯著低于或高于OVX+V組(P＜0.05)。OVX+V組軟骨終板區(qū)域可見X型膠原免疫組織化學染

18、色程度強于Sham組，而OVX+ALN組X型膠原染色強度低于OVX+V組。
　　 8、Real-time PCR檢測結(jié)果
　　 與Sham組相比，OVX+V組Col2α1 mRNA表達降低（P＞0.05），而aggrecan及Col1α1 mRNA表達顯著增高（P＜0.05）。而OVX+ALN組aggrecan及Col2α1 mRNA顯著高于OVX+V組（P＜0.05），Col1α1 mRNA表達顯著低于OVX+V組(P

19、＜0.05)。OVX+V組MMP-1、MMP-3及MMP-13mRNA表達顯著高于Sham組(P＜0.05)。而阿侖膦酸鈉可有效抑制由卵巢切除引起的MMP-1、MMP-3及MMP-13 mRNA表達的增高(P＜0.05)。
　　 第三部分阿侖膦酸鈉治療卵巢切除大鼠腰椎間盤退變作用效果的實驗研究
　　 目的:探討阿侖膦酸鈉對卵巢切除大鼠腰椎間盤退變的治療作用。
　　 方法:30只3月齡雌性SD大鼠隨機分為三組:(1

20、)假手術(shù)組（Sham）;(2)卵巢切除+鹽水治療組(OVX+V);(3)卵巢切除+可侖膦酸鈉治療組(OVX+ALN)。OVX+V組及OVX+ALN組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)切除雙側(cè)卵巢組織，Sham組大鼠僅暴露卵巢組織但不切除。OVX+ALN組大鼠于卵巢切除術(shù)3個月后給予阿侖膦酸鈉頸后皮下注射，劑量為15μg/kg，一周兩次。OVX+V組大鼠給予等體積的生理鹽水作為對照。卵巢切除術(shù)后6個月，過量失血處死各組大鼠并收集L3-6椎體標本。椎體骨

21、密度檢測及Micro-CT檢測用以評價大鼠腰椎椎體骨骼特性及微觀結(jié)構(gòu)的變化。應用van Gieson染色進行椎間盤組織學檢測及組織學評分。免疫組織化學染色用于檢測各組大鼠椎間盤中aggrecan、Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、MMP-1及MMP-13表達的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、椎體BMD檢測結(jié)果
　　 OVX+V組大鼠L3-4及L5-6椎體BMD顯著低于Sham組(P＜0.05)，而OVX+ALN組大鼠L3-4及

22、L5-6椎體BMD顯著高于OVX+V組（P＜0.05）。
　　 2、Micro-CT檢測結(jié)果
　　 OVX+V組BV/TV、Tb.N顯著低于Sham組，而Tb.Sp顯著高于Sham組（P＜0.05）。而OVX+ALN組椎體BV/TV、Tb.Th顯著高于OVX+V組，Tb.Sp顯著低于OVX+V組（P＜0.05）。
　　 3、椎間盤組織形態(tài)學觀察及評分結(jié)果
　　 OVX+V組髓核內(nèi)，脊索細胞數(shù)量顯著減少，并

23、出現(xiàn)大量軟骨樣細胞增殖，髓核內(nèi)可見粘液樣變性。在纖維環(huán)與髓核的過渡區(qū)出現(xiàn)大量體積較小的軟骨細胞增殖。軟骨終板內(nèi)異常鈣化現(xiàn)象較為明顯，并且在軟骨終板的中段出現(xiàn)大量的異位骨樣組織及髓腔。OVX+ALN組髓核內(nèi)脊索細胞數(shù)量未出現(xiàn)顯著性減少，髓核中出現(xiàn)一定量的軟骨樣細胞，并出現(xiàn)輕度的黏液樣變性。在纖維環(huán)與髓核交接處可見纖維軟骨細胞增殖現(xiàn)象。
　　 OVX+V組椎間盤組織學評分顯著高于Sham組（P＜0.05），而OVX+ALN組椎間盤組

24、織學評分顯著低于OVX+V組（P＜0.05），但Sham組與OVX+ALN組椎間盤組織學評分無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 4、免疫組織化學染色結(jié)果
　　 OVX+V組髓核內(nèi)aggrecan及Ⅱ型膠原表達較Sham組顯著降低，MMP-1及MMP-13表達增強，而OVX+ALN組aggrecan及Ⅱ型膠原表達高于OVX+V組，并且MMP-1及MMP-13表達弱于OVX+V組。OVX+V組纖維環(huán)中MMP-1及MMP-1

25、3表達增高，其IOD值顯著高于Sham組(P＜0.05)。但OVX+ALN組纖維環(huán)中MMP-1和MMP-13的表達顯著降低，其IOD值顯著低于OVX+V組（P＜0.05）。
　　 OVX+V組纖維環(huán)中Ⅱ型膠原表達降低，而Ⅰ型膠原表達增高，其IOD值分別顯著低于或高于Sham組（P＜0.05）。而OVX+ALN組纖維環(huán)中Ⅱ型膠原表達增強，Ⅰ型膠原表達減弱，其IOD值顯著高于或低于OVX+V組（P＜0.05）。
　　 OVX

26、+V組軟骨終板內(nèi)X型膠原表達顯著高于Sham組，而OVX+ALN組軟骨終板內(nèi)X型膠原表達較OVX+V組顯著降低。
　　 結(jié)論:
　　 1、卵巢切除大鼠椎體發(fā)生骨質(zhì)疏松同時可合并出現(xiàn)腰椎間盤的退行性改變。
　　 2、阿侖膦酸鈉可有效延緩卵巢切除大鼠腰椎間盤退變進程。其具體作用機制一方面可能與維持椎體及軟骨終板結(jié)構(gòu)的完整性及功能有關(guān)，另一方面與調(diào)控細胞外基質(zhì)代謝，保護椎間盤的功能有關(guān)。
　　 3、阿侖膦酸鈉是