Cathepsin L與人腰椎間盤退變關(guān)系的研究.pdf

1、人類椎間盤退變開始很早，并且是引起后背痛和神經(jīng)并發(fā)癥的最主要的原因。但關(guān)于椎間盤退變的病理過程我們還知之甚少。最近研究表明蛋白水解酶在椎間盤組織的破壞過程中起作用。除基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)外，組織蛋白酶(Cathepsins)也是能夠降解膠原和粘蛋白的蛋白水解酶。已有研究表明Cathepsins在骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨的破壞過程中起作用。然而，關(guān)于Cathepsins在椎間盤退變中的作用的研究還較少。本次試驗采用免疫組織

2、化學(xué)S-P法和逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測人腰椎間盤細(xì)胞Cathepsin L蛋白表達(dá)，研究Cathepsin L與人腰椎間盤退變的關(guān)系。 實驗對象: 實驗所用間盤取自術(shù)中(2005年1月至2005年12月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科手術(shù)治療的患者)，退變組25例(腰椎間盤突出癥患者，男11例，女14例，23～68歲。)；并根據(jù)術(shù)中所見將腰間盤突出分為非包含型組(11例)和包含型組(14例)；對照組間盤

3、5例(胸腰段骨折行前路手術(shù)患者，取手術(shù)中切除的間盤組織，并經(jīng)MRI T2加權(quán)間盤信號改變程度驗證其為正常間盤，男3例，女2例，21～32歲)。 實驗方法: 一、H E染色組織學(xué)觀察4 μm石蠟切片經(jīng)脫蠟至水，蘇木素浸染10分鐘，蒸餾水15分鐘，而后伊紅染色數(shù)秒鐘，顯微鏡下觀察。 二、免疫組織化學(xué)S-P法檢測椎間盤細(xì)胞Cathepsin L的蛋白表達(dá)4 μm石蠟切片脫蠟至水；用體積分?jǐn)?shù)3％的H<,2>O<,2>室溫

4、孵育10分鐘，封閉內(nèi)源性過氧化氫酶；P B s浸泡沖洗3次，每次4分鐘；5％正常山羊血清室溫孵育20分鐘封閉非特異性染色；滴加兔抗人Cathepsin L單克隆抗體適量，4℃過夜；P B S浸泡沖洗3次，每次4分鐘，滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃20min；DA B顯色，麥?zhǔn)咸K木素輕度復(fù)染，封片后顯微鏡觀察。 三、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(R T-P C R)檢測Catheps i n L基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平美國Medline

5、國立圖書館基因庫檢索基因，應(yīng)用電腦軟件primer 5．0版自行設(shè)計Cathepsin L引物，北京三搏遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。上游：5'CAA CCAAGG CTT、TGA GM、-3'；下游：5'-TCC AAG GGA GTG TTC AGG-3'。Cathepsin L預(yù)計擴(kuò)增片段為366bp，并選用β肌動蛋白(β-actin)為參照物，半定量檢測Cathepsin L基因轉(zhuǎn)錄水平。 (1)提取總R N A。(2)R N A含

6、量及純度測定。(3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)條件為：6 5℃1 min→30℃5min→15-30min內(nèi)勻速升溫至6 5℃→6 5℃3 0 min→9 8℃5 min→5℃5min。(4)P C R反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：①94℃3 min→②84℃45sec→③56.7℃1min→④72℃1min→⑤72℃7min②-④循環(huán)35次。(5)P C R產(chǎn)物于2％瓊脂凝膠電泳，Kodak電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)下觀察、攝像及掃描分析。以Ca

7、tepsin L基因條帶的吸光度容積與β-actin條帶的吸光度容積的比值作為目的基因的m R N A的相對含量。 四、統(tǒng)計分析 利用SPSS 10．0 For windows統(tǒng)計軟件進(jìn)行x<'2>檢驗及t檢驗，比較退變組和對照組、非包含型組和包含型組樣本間盤細(xì)胞Cathepsin L陽性率及CathepsinL基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果: 一、HE染色組織學(xué)觀察 在退變

8、組間盤中，各標(biāo)本均表現(xiàn)出一定的退變特征：纖維環(huán)原有的板層結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞數(shù)量減少，失去原有軟骨細(xì)胞形態(tài)，常有多個細(xì)胞被暈輪環(huán)繞，部分細(xì)胞漿成分極少。 二、免疫組織化學(xué)s-P法檢測椎間盤細(xì)胞Cathepsin L的蛋白表達(dá) Cathepsin L陽性染色定位于細(xì)胞漿。在對照組間盤中，多數(shù)樣本CathepsinL陽性細(xì)胞率低；但是個別樣本陽性細(xì)胞率較高。在退變間盤中，多數(shù)樣本Cathepsin L陽性率較高，但也有個別樣本陽性

9、細(xì)胞率較低，在非包含型組與包含型組相比有較高的Cathepsin L陽性細(xì)胞率。 三、逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(R T-P C R)檢測Catheps i n L基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平 Cathepsin L基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平在對照組中均較低；退變組中均有較強(qiáng)表達(dá)。在非包含型組比包含型組亦有較高的轉(zhuǎn)錄水平。 四、統(tǒng)計分析 結(jié)果退變組間盤細(xì)胞Cathepsin L陽性率及其基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于對照組、非包

10、含型組高于包含型組。x<'2>檢驗及t檢驗分析證實組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 討論: 椎間盤退變已經(jīng)被公認(rèn)為是引起脊柱退行性變的主要原因，伴隨年齡增大所引起的椎間盤老化或退變可能是基質(zhì)合成和破壞之間不平衡所引起的。最近的研究結(jié)果表明蛋白水解酶在椎間盤組織的破壞過程中起作用。并且最近研究證實了MMP-3和膠原酶在退變的椎間盤組織中的表達(dá)。并且除MMPs外，Cathepsins也是能夠降解膠原和粘蛋白的蛋白水解酶

11、。有研究表明Cathepsins在骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎所致的關(guān)節(jié)軟骨的破壞過程中起作用。關(guān)節(jié)軟骨的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性與椎間盤非常類似，因此推想Cathepsins也可能在椎間盤退變的病理過程中發(fā)揮作用。 在本實驗中，多數(shù)退變腰椎間盤中CATL表達(dá)陽性率高，且退變組間盤CATI。基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平比正常組間盤高，為證明CATL參與間盤退變提供了直接證據(jù)。實驗表明Cathepsin L能降解I型和Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、和

12、連結(jié)蛋白這些間盤細(xì)胞外基質(zhì)成份，從而在間盤的退變過程中發(fā)揮著重要的作用。CATL和MMPs間一個顯著差別是它們的最適PH值不同。MMPs近中性，而CATL則為偏酸性。椎間盤是人體內(nèi)最大的無血運組織，細(xì)胞分裂極不活躍，被動擴(kuò)散營養(yǎng)方式使椎間盤的中央?yún)^(qū)營養(yǎng)差，并伴有低氧損傷。無氧代謝產(chǎn)生的乳酸造成內(nèi)部的低PH環(huán)境，體內(nèi)試驗證實退變間盤內(nèi)的PH值介于5.7-6.3。這不僅損害了細(xì)胞的新陳代謝，影響細(xì)胞的生物合成功能，還為CATL發(fā)揮細(xì)胞外蛋白

13、水解酶作用、降解細(xì)胞外基質(zhì)提供了適宜條件。 間盤退變的實質(zhì)是椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的改變及基質(zhì)與細(xì)胞粘附功能減退導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。在擴(kuò)張型心肌病的研究中發(fā)現(xiàn)：Cathepsin L通過壞死和凋亡引起大量心肌細(xì)胞死亡后，心室進(jìn)行重塑，最后導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病。在椎間盤的增齡性改變中發(fā)生的凋亡過程可能也有CATL的參與。 盡管我們的結(jié)果表明在椎間盤退變過程中有Cathepsin L的表達(dá)上調(diào)，然而Cathepsin L的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚

14、。據(jù)報告炎性細(xì)胞因子和生長因子是CathepsinL合成的調(diào)節(jié)因子，這些因子可能是外來的也可能是椎間盤細(xì)胞自己合成的，都與Cathepsin L的調(diào)控密切相關(guān)，這些還有待于進(jìn)一步的闡明。 綜上所述Cathepsin L參與了人腰椎間盤退變的病理過程，但是其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究，另外Cathepsin L的調(diào)節(jié)機(jī)制尚還不清楚。并且在本次實驗中的部分正常間盤中Cathepsin L的表達(dá)也提示了Cathepsin L在參與間盤