滿天星異葒草苷對(duì)肝星狀細(xì)胞NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響.pdf

1、目的：
　　核因子-κB(nuclear transcription factor-kappa B，NF-κB)作為一種廣泛存在體內(nèi)細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與免疫、炎癥及細(xì)胞增殖的調(diào)控。近年來(lái)研究認(rèn)為抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)、誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，是治療肝纖維化的一條重要途徑。本研究基于NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，旨在研究滿天星異葒草苷（2″-O-α-L-阿拉伯糖異葒草苷，IOA）對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控作用，探討其體外抗肝纖維化的

2、作用機(jī)制。
　　方法：
　　本研究采用的肝星狀細(xì)胞包括HSC-T6、LX2和7702。細(xì)胞分為6組：正常組，IL-1β刺激組，陽(yáng)性藥組（PDTC組），異葒草苷低、中、高劑量組（IOAL、IOAM、和IOAH組）。采用 MTT法、集落生成法、劃痕實(shí)驗(yàn)、AnnexinⅤ-FITC/PI和AO-EB染色分別檢測(cè)細(xì)胞增殖、集落形成、遷移、凋亡及細(xì)胞周期；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA法）檢測(cè)細(xì)胞上清Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）、腫瘤壞死因

3、子-α（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的含量；免疫組化法測(cè)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（NF-κB p65）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、Ⅲ型膠原（Col-Ⅲ）的表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)Ⅰ型膠原（Col-I）、Col-Ⅲ、NF-κB p65、核因子κB抑制蛋白α亞基（IκBα）、TGF-β1和TNF-α mRNA的表達(dá)；Western blot法檢測(cè)磷酸化NF-κB p65（p-p65）、NF-κB p50、Iκ

4、Bα、Col-I、NF-κB核轉(zhuǎn)位及細(xì)胞漿磷酸化IκBα（p-IκBα)、細(xì)胞核 NF-κB p65的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　（1）IOA對(duì)細(xì)胞增殖、集落形成、遷移、凋亡及細(xì)胞周期的影響
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IOA對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用，呈濃度依賴(lài)性（P<0.05或P<0.01）。與正常組相比，IL-1β刺激組細(xì)胞增殖明顯增加（P<0.01），細(xì)胞遷移及集落生成明顯加快、增多，細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞周期無(wú)明顯改變；經(jīng)藥物

5、干預(yù)后，PDTC與IOAL、IOAM、IOAH均能顯著抑制HSCs增殖、遷移及集落的生成，提高細(xì)胞凋亡率，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在G2期，引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化（P<0.05或P<0.01）。這些結(jié)果表明，IOA能明顯抑制肝星狀細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡，從細(xì)胞水平上證實(shí)了IOA抗肝纖維化的機(jī)制與抑制肝星狀細(xì)胞的增殖活化有關(guān)，為其靶向治療肝纖維化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　（2）IOA對(duì)膠原的影響
　　RT-PCR研究結(jié)果顯示，與正常

6、組相比，IL-1β可明顯上調(diào)HSC-T6、LX2細(xì)胞Col-I和Col-ⅢmRNA的表達(dá)（P<0.01）；ELISA試劑盒、免疫組化結(jié)果顯示，與正常組相比，IL-1β刺激組細(xì)胞Col-Ⅲ合成和分泌明顯增多（P<0.05或P<0.01）；Western blot研究結(jié)果顯示，與正常組相比，IL-1β刺激組Col-I的表達(dá)顯著提高（P<0.05或P<0.01）。經(jīng)藥物干預(yù)后，PDTC和IOAL、IOAM、IOAH均能顯著下調(diào)Col-I和Co

7、l-ⅢmRNA和蛋白的表達(dá)，抑制 Col-Ⅲ合成和分泌，降低Col-I含量（P<0.05或P<0.01）。提示，IOA能明顯抑制肝星狀細(xì)胞膠原的合成與沉積，抑制ECM生成，是其抗肝纖維化發(fā)生發(fā)展的藥理學(xué)基礎(chǔ)。
　?。?）IOA對(duì)炎癥因子的抑制作用
　　ELISA試劑盒檢測(cè)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，IL-1β可顯著上調(diào)HSC-T6和LX2細(xì)胞TNF-α、TGF-β1的含量和mRNA的表達(dá)（P<0.01）。經(jīng)藥物干預(yù)后，

8、PDTC與IOA均能顯著降低TNF-α、TGF-β1的含量，顯著下調(diào)HSC-T6細(xì)胞 TNF-α、TGF-β1 mRNA的表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果表明，IOA能顯著抑制肝星狀細(xì)胞炎癥因子的釋放，減輕炎癥損傷，是其改善肝纖維化的作用機(jī)制之一。
　?。?）IOA對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）的影響
　　免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，IL-1β刺激組HSC-T6、LX2細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)明顯提高（P<0.01

9、）。經(jīng)藥物干預(yù)后，PDTC與IOAM、IOAH均能顯著降低MMP-9蛋白表達(dá)（P<0.05或P<0.01）。這些數(shù)據(jù)提示，IOA抑制肝星狀細(xì)胞膠原的生成與其降低MMP-9的活性有關(guān)。
　?。?）IOA對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PDTC與IOA均能顯著下調(diào)HSC-T6、LX2細(xì)胞NF-κB P65 mRNA的表達(dá)，并上調(diào) IκBα mRNA的表達(dá)（p<0.01）。Western Blot結(jié)

10、果顯示，IL-1β刺激組細(xì)胞p-p65、NF-κB p50、細(xì)胞漿p-IκBα、細(xì)胞核NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.01），細(xì)胞漿 NF-κB p65和 IκBα表達(dá)明顯減低（P<0.05或P<0.01）。經(jīng)藥物干預(yù)后，上述情況得到逆轉(zhuǎn)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65陽(yáng)性染色細(xì)胞增多濃染，提示 IL-1β可以誘導(dǎo)NF-κB活化；經(jīng)藥物干預(yù)后，PDTC與IOA細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)減少淡染，

11、核轉(zhuǎn)位減少，表明IOA可減少細(xì)胞核 NF-κB p65表達(dá)，阻止NF-κB核轉(zhuǎn)位，從而抑制NF-κB活化，對(duì)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路有明顯的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　IOA能抑制 IL-1β誘導(dǎo)的增殖，阻滯細(xì)胞于G2期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少膠原的合成和分泌，降低炎癥細(xì)胞因子的釋放；IOA可調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶的水平，抑制IκBα磷酸化、細(xì)胞核 NF-κBp65表達(dá)和 NF-κB核轉(zhuǎn)位。這些結(jié)果表明，IOA能明顯抑制肝星狀細(xì)胞的活