中國(guó)青島文昌魚C型凝集素AmphiCTL的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)性質(zhì)研究.pdf

1、文昌魚是一個(gè)介于脊椎動(dòng)物與無(wú)脊椎動(dòng)物的過(guò)渡物種，其天然免疫系統(tǒng)相對(duì)完善。參與模式識(shí)別反應(yīng)的模式識(shí)別受體在文昌魚的天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。本文通過(guò)一系列研究手段，對(duì)中國(guó)青島文昌魚的一個(gè)第Ⅶ組C型凝集素進(jìn)行研究，以闡述C型凝集素在文昌魚如何通過(guò)識(shí)別并排除病原體而發(fā)揮作用，并進(jìn)一步確定模式識(shí)別受體在文昌魚天然免疫中的重要地位。 我們從青島文昌魚全魚cDNA表達(dá)文庫(kù)的EST分析中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼C型凝集素結(jié)構(gòu)域的cDNA序列?？寺?/p>

2、到序列全長(zhǎng)，命名為AmphiCTL。經(jīng)分析確定這是一個(gè)編碼一個(gè)N-末端的信號(hào)肽及一個(gè)C-末端的C型凝集素結(jié)構(gòu)域的C型凝集素序列。整體結(jié)構(gòu)與脊椎動(dòng)物的第Ⅶ組C型凝集素一致。 通過(guò)realtime-PCR和成體切片原位雜交檢測(cè)了AmphiCTL的表達(dá)模式。在胚胎的發(fā)育早期(囊胚、早原腸胚)，AmphiCTL的表達(dá)量達(dá)到頂峰。AmphiCTL在所有組織中均有表達(dá)，在肝盲囊中表達(dá)量最高，在皮膚和消化道表達(dá)量也比較高。在對(duì)文昌魚進(jìn)行免疫刺

3、激后，發(fā)現(xiàn)文昌魚在革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的感染下卻能夠引起高達(dá)400倍基因表達(dá)量上調(diào)，酵母聚糖(Zymosan)和釀酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)刺激后AmphiCTL的表達(dá)量提高至70倍。 本文構(gòu)建了重組融合蛋白表達(dá)載體pTRX-AmphiCTL，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了原核表達(dá)，并用Ni<'2+>-Chelating Sepharose

4、親和層析柱進(jìn)行分離純化，得到較純的重組融合蛋白。用純化后的重組蛋白進(jìn)行功能的初步探索：通過(guò)細(xì)胞凝集活力測(cè)定證實(shí)AmphiCTL具有凝集素最基本的功能——紅細(xì)胞凝集活性；通過(guò)糖抑制凝集活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)除葡萄糖在高達(dá)150 mM的濃度仍然不能抑制重組蛋白對(duì)紅細(xì)胞的凝集活性外，其余的糖類在適當(dāng)濃度下均能不同程度抑制蛋白的紅細(xì)胞凝集活性。通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AmphiCTL的對(duì)金葡菌的直接殺死作用，我們認(rèn)為AmphiCTL可能代表了文昌魚中一種原始