擬南芥AtMEK5相互作用蛋白的篩選及AtMAPK3-AtMAPK6對(duì)AtPLC2的體外磷酸化分析.pdf

1、植物中的MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)系統(tǒng)(mitogen-activated bprotein kinase cascade)參與激素信號(hào)、生物脅迫、細(xì)胞分裂和植物生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)由MPKKK,MAPK和MAPK組成。磷酸化激活的MAPK可通過(guò)對(duì)下游底物分子的磷酸化，最終使外界或胞內(nèi)信號(hào)得以傳遞。在擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中，AtMEK5的持續(xù)激活突變體(AtMEK5<'DD>)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，可以激活內(nèi)源的AtMPK6和AtMP

2、K3，最終引起細(xì)胞死亡的發(fā)生。我們通過(guò)酵母雙雜交對(duì)AtMEK5介入的級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的下游底物進(jìn)行了篩選，用激酶體外磷酸化的方法研究該級(jí)聯(lián)系統(tǒng)對(duì)AtPLC2的磷酸化。 用酵母雙雜交系統(tǒng)從擬南芥的cDNA文庫(kù)中篩選到近95個(gè)可能的陽(yáng)性克隆在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上生長(zhǎng)且濾紙顯藍(lán)色，測(cè)序近40個(gè)，其中28個(gè)讀碼框正確參與的信號(hào)通路中的其它相關(guān)蛋白，再經(jīng)酵母雙雜交重復(fù)驗(yàn)證排除假陽(yáng)性克隆，得到10個(gè)陽(yáng)性克隆。用酵母雙

3、雜交對(duì)克隆的多個(gè)MAPKK和MAPK進(jìn)行互作實(shí)驗(yàn)，確證了AtMEK5可與AtMPK6、AtMPK3相互作用。 磷脂酶C(PLC)能使質(zhì)膜上的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG)兩個(gè)第二信使，DAG激活下游蛋白激酶，IP3則參與調(diào)控Ca<'2+>相關(guān)的信號(hào)過(guò)程。PLC參與了細(xì)胞中諸多生理過(guò)程和對(duì)外界刺激的反應(yīng)的信號(hào)調(diào)節(jié)。我們對(duì)酵母雙雜交篩選出的AtPLC2與AtMEK5、

4、AtMPK6和AtMPK3的作用進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。結(jié)果證明，AtPLC2的C2結(jié)構(gòu)域與AtMEK5、AtMPK6和AtMPK3相互作用。AtPLC2、AtPLC2 ⊿100可以被激活的AtMPK3和AtMPK6體外磷酸化，推測(cè)磷酸化位點(diǎn)或與磷酸化關(guān)系密切的部分是AtPLC2的X區(qū)域。 目前，植物PI-PLC家族的功能研究還很缺乏，未見(jiàn)植物PLC直接受MAPK調(diào)控的相關(guān)報(bào)道。我們的研究結(jié)果對(duì)于研究植物MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的功能及植物