紅豆杉紫杉烷14β-羥基化酶基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、紫杉醇(tax01)首次從短葉紅豆杉(Taxus Brevifolia Nutt)樹皮中分離得到，是迄今為止少數(shù)幾個最具抗癌活性的天然化合物之一，對卵巢癌、乳腺癌等均有顯著療效。由于紫杉醇在植物體內(nèi)的含量相當(dāng)?shù)?，而且紅豆杉屬植物生長緩慢，這對紫杉醇的進(jìn)一步開發(fā)利用造成了很大的困難。C-14氧取代紫杉烷類化合物具有與紫杉醇共同的生物合成前體，且含量較高，有望通過基因調(diào)控的手段在降低C-14氧取代紫杉烷類的同時提高包括紫杉醇在內(nèi)的C-13氧

2、取代紫杉烷類的合成水平。 反義RNA和RNA干擾(RNAi)技術(shù)是目前研究植物基因功能較為常用和有效的方法，RNA干擾更是一種研究基因功能的重要新工具。紫杉烷14 β-羥基化酶(14OH)存在于紫杉醇類物質(zhì)生物合成的分支途徑中，為此本文利用反義RNA和RNA干擾技術(shù)對紅豆杉細(xì)胞內(nèi)14 β-羥基化酶基因進(jìn)行調(diào)控，其目的是抑制甚至沉默該基因，從而對其效應(yīng)及基因功能進(jìn)行研究分析；同時，在前人的基礎(chǔ)上優(yōu)化紅豆杉細(xì)胞系的培養(yǎng)條件和再生體系

3、，并對其遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了初步研究。本文主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下： (1)紅豆杉含有大量多糖多酚類物質(zhì)，提取基因組總DNA時采用了改良方法，避免了酚類物質(zhì)與DNA結(jié)合，提高了提取效果。 (2)本研究克隆得到14OH基因915bp的DNA片段，將它與報(bào)道的14OH基因進(jìn)行同源性比較后發(fā)現(xiàn)16個堿基有差異，同源性為98.3％。 (3)紅豆杉離體培養(yǎng)細(xì)胞在增殖過程中，自身富含的酚類被氧化成醌類物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞褐變甚至死

4、亡，在與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時褐變現(xiàn)象更為嚴(yán)重。本研究采用定期進(jìn)行繼代更換新鮮培養(yǎng)基，同時在培養(yǎng)基中加入適量的PVPP抗氧化劑的方法防止褐變，使細(xì)胞保持良好的生長活力。 (4)紅豆杉再生體系構(gòu)建研究表明，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生中外植體的選擇(本試驗(yàn)中具體指未成熟胚的發(fā)育階段)對體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)起著重要作用；同時，利用器官發(fā)生的分化途徑再生紅豆杉植株效率很低，有待于進(jìn)一步探索。 (5)本研究利用反義RNA和RNAi技術(shù)成功地抑制了紅豆杉

5、細(xì)胞中紫杉烷14 β-羥基化酶基因的表達(dá)。其中RNA干擾技術(shù)對目的基因的抑制效果優(yōu)于反義RNA技術(shù)，且特異性高的RNAi植物表達(dá)載體pZ14b的抑制效率明顯高于pZ14a。 (6)比較質(zhì)粒浸泡法直接對紅豆杉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和工程農(nóng)桿菌的植物遺傳轉(zhuǎn)化，前者效果明顯好于后者，基本上使目的基因完全沉默不表達(dá)。 (7)化學(xué)成分分析證實(shí)了紫杉烷14 β-羥基化酶基因在紫杉烷類生物合成調(diào)控中的重要作用：紫杉烷14 β-羥基化酶基因表達(dá)受