紅豆杉紫杉烷13α-,14β-羥基化酶基因調(diào)控及茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下的蛋白表達(dá).pdf

1、紫杉醇（taxol）是Wall等首次從短葉紅豆杉(TaxusBrevifolia)樹皮中分離得到的一種重要的次生代謝產(chǎn)物，是迄今為止最具抗癌活性的天然化合物之一。本論文圍繞紫杉醇的生物合成過程展開了以下研究：
　　 1、紫杉烷13α-，14β-羥基化酶基因調(diào)控研究
　　 紫杉醇生物合成全過程約20步酶促反應(yīng)。其中，紫杉烷13α-羥基化酶(簡稱13OH)是紫杉醇生物合成途徑的關(guān)鍵羥化酶。而紫杉烷14β-羥基化酶(簡稱14O

2、H)存在于包括紫杉醇在內(nèi)的各種C-13氧取代的紫杉烷生物合成分支途徑中。如果能夠抑制紫杉醇生物合成的分支途徑，則有可能提高該物質(zhì)的生物合成產(chǎn)量。應(yīng)用本試驗(yàn)室構(gòu)建好的紫杉烷13α-羥基化酶基因正向表達(dá)載體、14-β羥基化酶基因反義RNA表達(dá)載體、14-β羥基化酶基因RNAi表達(dá)載體和幾種可能對紫杉醇生物合成產(chǎn)生影響的miRNA表達(dá)載體，以曼地亞紅豆杉（Taxusxmedia）愈傷組織細(xì)胞為材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，并運(yùn)用southernblot

3、、RT-PCR、HPLC等技術(shù)進(jìn)行了分析，結(jié)果如下：
　　 (1)建立了一套將轉(zhuǎn)基因方法應(yīng)用于紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞的高效、完整的轉(zhuǎn)化體系，對紅豆杉愈傷組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)化成功率達(dá)到了100％。并探討了幾種影響轉(zhuǎn)化效率的因素。
　　 (2)利用14-β羥基化酶基因RNAi表達(dá)載體(pZ14aRNAi、pZ14bRNAi)以及14-β羥基化酶基因反義RNA表達(dá)載體(pZ14c)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。Southern檢測初步證實(shí)外源基

4、因已經(jīng)整合到了植物基因組中；RT-PCR分析結(jié)果表明，內(nèi)參基因β-actin在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)水平基本一致，而14OH基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的表達(dá)水平相對非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系顯著下降。HPLC結(jié)果分析顯示，轉(zhuǎn)基因的紅豆杉細(xì)胞與對照相比三種C-14氧取代紫杉烷(yunnanxane，sinenxanA，sinenxanC)的含量發(fā)生了較大的改變。其中主要的紫杉烷SinenxanA含量明顯下降，三種紫杉烷在轉(zhuǎn)基因紅豆杉細(xì)胞中的總含量呈顯著

5、下降趨勢。
　　 (3)利用pC13OH載體轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。GUS檢測，熒光觀察及southernblot分析初步證明pC13OH載體（13α-羥基化酶基因正向表達(dá)載體）成功轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果表明，內(nèi)參基因β-actin在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中表達(dá)水平一致，而13OH基因在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著，卻在對照中未表達(dá)。HPLC檢測三種C-14氧取代紫杉烷類化合物的總量在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中均略微有所下降。
　　

6、 (4)其他轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。本研究還進(jìn)行了pC13OH、pZ14a共轉(zhuǎn)化，pC13OH、pZ14b共轉(zhuǎn)化，pC130H、pZ14c共轉(zhuǎn)化，pC13OH、pCO169d共轉(zhuǎn)化，pC13OH、pE415共轉(zhuǎn)化紅豆杉細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。另外，利用構(gòu)建的幾種miRNA表達(dá)載體如169d、pROK2-JERFs也對曼地亞紅豆杉細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)化后的樣品進(jìn)行分析顯示，共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)及幾種miRNA表達(dá)載體均未對紫杉醇生物合成途徑產(chǎn)生較大影響。

7、>　　 2、茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下紅豆杉細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達(dá)
　　 已有的研究表明采用茉莉酸甲酯(MJ)誘導(dǎo)可以有效的提高紫杉醇及紫杉烷類物質(zhì)在紅豆杉細(xì)胞中的含量。研究該物質(zhì)誘導(dǎo)的作用機(jī)制，可以更全面了解茉莉酸甲酯對紅豆杉細(xì)胞基因表達(dá)的影響，找到可能與紫杉醇生物合成相關(guān)的重要基因或轉(zhuǎn)錄因子。本試驗(yàn)利用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)中國紅豆杉（Taxuschinensis）愈傷組織細(xì)胞，采用雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)對茉莉酸甲酯誘導(dǎo)15天后細(xì)胞中的蛋白質(zhì)變

8、化進(jìn)行了分析，找到22個差異表達(dá)的蛋白。經(jīng)過肽質(zhì)量指紋分析、數(shù)據(jù)庫查詢，初步斷定CK(對照組)中的219號、231號、156號、127號蛋白分別與actin2（一種細(xì)胞骨架蛋白）、enolase（烯醇酶，一種參與糖酵解系統(tǒng)的酶，催化2-磷酸甘油酸失水而生成磷酸烯醇丙酮酸反應(yīng)的酶）、F1-ATP酶α亞單位、maturaseK（一種成熟酶）具有同源性。經(jīng)過茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，該四種蛋白的表達(dá)量均有不同程度的降低。這可能與茉莉酸甲酯誘導(dǎo)引起紅豆

9、杉細(xì)胞的凋亡有關(guān)。另外，有10個蛋白與數(shù)據(jù)庫中所有蛋白的同源性都很低，可能代表了中國紅豆杉中與茉莉酸甲酯誘導(dǎo)相關(guān)的未知蛋白。
　　 3、抗凋亡抑制劑DEVD-CapaseⅢ對紫杉醇生物合成的影響
　　 DEVD-CapaseⅢ是一種抗細(xì)胞凋亡抑制劑，在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)基加入該物質(zhì)則有可能抑制細(xì)胞的凋亡從而達(dá)到提高紫杉醇生物合成產(chǎn)量的目的。以曼地亞紅豆杉愈傷組織作為實(shí)驗(yàn)材料，采用添加200μMMj（茉莉酸甲酯）的6，7-V作

10、為培養(yǎng)基，試驗(yàn)組加入50μM的Ac-DEVD-CMK，分別在繼代9天和21天后取樣，觀察細(xì)胞的顏色、生長情況等，并運(yùn)用HPLC方法對細(xì)胞中的紫杉烷成分的種類及含量進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MJ誘導(dǎo)后并未在曼地亞紅豆杉細(xì)胞中檢測到紫杉醇的變化，說明本試驗(yàn)中細(xì)胞的凋亡并不是主要由于紫杉醇的積累而是由于MJ引發(fā)的反應(yīng)；在細(xì)胞生長周期的早期階段加入Ac-DEVD-CMK，不能阻止Caspase的活性，未能抑制愈傷組織細(xì)胞的凋亡。
　　 4、未

11、知化合物的鑒定
　　 無論是在轉(zhuǎn)基因還是MJ誘導(dǎo)試驗(yàn)過程中，我們均檢測到了一種未知化合物，并對該化合物進(jìn)行了純化試驗(yàn)。該物質(zhì)在HPLC色譜圖上的保留時間比紫杉醇的保留時間延遲了大約0.4min。將該物質(zhì)的二級質(zhì)譜圖與分子量類似的已知化合物的譜圖進(jìn)行比對，沒有發(fā)現(xiàn)完全吻合的質(zhì)譜特征。經(jīng)過HPLC-HRMS分析得到該未知化合物分子量為851.39747，在Xcaliburversion2.2軟件中計算得到最可能是C46H55O10N

12、6等化合物中的一種。
　　 結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)建立了一套高效轉(zhuǎn)基因體系，并應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功地抑制了曼地亞紅豆杉細(xì)胞系中14OH基因的表達(dá)，C-14位氧化紫杉烷類含量在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中均有所下降；(2)在采用茉莉酸甲酯(MJ)誘導(dǎo)中國紅豆杉愈傷組織細(xì)胞的試驗(yàn)中，鑒定了四種并發(fā)現(xiàn)了10個可能與茉莉酸甲酯誘導(dǎo)有關(guān)的蛋白；(3)抗凋亡抑制劑DEVD-CapaseⅢ未對紫杉醇生物合成產(chǎn)生較大的影響；(4)在實(shí)驗(yàn)過程中檢測到了一種有可能縣未