ART1促進(jìn)大腸癌微血管形成及其機(jī)制的初步探討.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究目的:
  單ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶(mono(ADP-ribosyl)transferase,ARTs)催化單ADP核糖基化反應(yīng)(mono-ADP-ribosylation),對細(xì)胞多種蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾,參與細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞分化、增殖、蛋白分泌及運(yùn)輸?shù)壬砑安±磉^程。已有研究發(fā)現(xiàn) ARTs可以參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能相關(guān)因子影響淋巴細(xì)胞功能,從而參與并促進(jìn)炎癥過程。在腫瘤性疾病中,有研究發(fā)現(xiàn)幽門螺旋桿菌可以調(diào)節(jié)ARTs的活性

2、,繼而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞膜蛋白的構(gòu)像,可能與胃癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)系。還有研究也顯示,肺癌A549細(xì)胞中及肝癌組織及HepG2細(xì)胞中均存在ART1的高表達(dá),并提示與腫瘤的轉(zhuǎn)移浸潤相關(guān);我們之前的研究也顯示ART1對大腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等具有調(diào)節(jié)作用。眾所周知,腫瘤組織的血管生成與腫瘤的生長、浸潤及預(yù)后有密切關(guān)系。但 ART1與腫瘤血管生成關(guān)系尚不清楚。本研究在先前研究基礎(chǔ)上,以人大腸癌組織、人源性大腸癌LOVO細(xì)胞以及鼠源性大腸癌CT26細(xì)胞

3、為研究對象,從腫瘤細(xì)胞及人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)兩方面著手,探討ART1對大腸癌血管生成的影響和可能的分子機(jī)制,為尋找抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵潤新的可能靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
  研究方法:
  本研究共分三部分進(jìn)行。
  1、ART1在人大腸癌組織及LOVO細(xì)胞中的表達(dá)及其與血管生成相關(guān)因子表達(dá)、腫瘤微血管密度(MVD)關(guān)系的研究
  (1) ART1、VEGF、bFGF及整合素αVβ3在人大腸癌組織中的表達(dá)及其

4、與腫瘤微血管密度關(guān)系研究
  通過免疫組化及免疫熒光雙標(biāo)法檢測人大腸癌組織中 ART1與VEGF、bFGF及整合素αVβ3等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)與ART1/VEGF, ART1/bFGF, ART1/整合素αVβ3的共表達(dá),評估其與腫瘤MVD的關(guān)系.
  (2) MIBG對人大腸癌 LOVO細(xì)胞 VEGF、bFGF及整合素αVβ3表達(dá)影響的研究
  通過免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測ART1特異性抑制劑MIBG應(yīng)用后人大腸

5、癌LOVO細(xì)胞中VEGF、bFGF及整合素αVβ3等血管生成相關(guān)因子表達(dá)變化及相互關(guān)系。
  2、ART1對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及微血管形成影響的離體及在體研究
  (1) ART1特異性抑制劑MIBG對VEGF及bFGF誘導(dǎo)的HUVECs增殖、遷移及血管形成能力影響的研究
  應(yīng)用 CCK8、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及三維立體培養(yǎng)法觀察 VEGF及bFGF誘導(dǎo)HUVECs增殖、遷移速度及血管形成情況,觀察加入AR

6、T1特異競爭性抑制劑MIBG后,HUVECs增殖、遷移速度及血管形成的變化。
  (2) ART1基因沉默及高表達(dá)的大腸癌LOVO細(xì)胞VEGF及bFGF的表達(dá)及其對HUVECs增殖、遷移和血管形成能力影響的研究
  用攜帶 ART1-shRNA和 ART1-cDNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染大腸癌LOVO細(xì)胞,建立大腸癌 LOVO細(xì)胞穩(wěn)定的 ART1基因沉默(ART1-shRNA)及高表達(dá)(ART1-cDNA)轉(zhuǎn)染株。以未轉(zhuǎn)染的LOV

7、O細(xì)胞(Untreated)及轉(zhuǎn)染慢病毒空載體的LOVO細(xì)胞(LV-control)為對照組,免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測各組LOVO細(xì)胞VEGF及bFGF的表達(dá);CCK8檢測不同組別LOVO細(xì)胞培養(yǎng)上清液對HUVECs增殖的影響;用 transwell小室建立轉(zhuǎn)染 LOVO細(xì)胞株與 HUVECs共培養(yǎng)系統(tǒng),觀察與不同組別LOVO細(xì)胞共培養(yǎng)的HUVECs遷移速度變化,并采用三維立體培養(yǎng)法觀察其血管形成情況。
  (3)ART1對小鼠移

8、植瘤微血管形成影響的在體研究
  應(yīng)用攜帶ART1-shRNA或ART1-cDNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠大腸癌CT26細(xì)胞株,并建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞小鼠脾臟移植瘤模型,采用免疫組化法檢測不同組別移植瘤中 CD34的表達(dá),計數(shù)不同轉(zhuǎn)染組移植瘤組織中微血管密度(MVD),評估ART1與小鼠移植瘤腫瘤微血管形成的關(guān)系。
  3、ART1影響大腸癌微血管形成可能機(jī)制的初步研究
  從腫瘤細(xì)胞及HUVECs兩個方面初步探討ART1對腫瘤微

9、血管形成相關(guān)信號通路的可能作用。
 ?。?) ART1對大腸癌LOVO細(xì)胞影響血管形成可能機(jī)制的初步研究
  以Untreated組及LV-control組為對照組,采用Western Blot檢測攜帶ART1-shRNA和ART1-cDNA載體的各組LOVO細(xì)胞及各組CT26細(xì)胞小鼠移植瘤中Akt、p-Akt、HIF-1a、VEGF及bFGF蛋白表達(dá)變化。
  (2)ART1對VEGF及bFGF誘導(dǎo)的HUVECs血管

10、形成影響可能機(jī)制的初步研究
  檢測 ART1特異競爭性抑制劑 MIBG對 HUVECs中 RhoA、ROCK1、P-ROCK1、FAK及P-FAK的表達(dá)的影響。
  研究結(jié)果:
  1、ART1在人大腸癌組織及LOVO細(xì)胞中的表達(dá)及其與血管生成相關(guān)因子表達(dá)、腫瘤微血管密度的關(guān)系
  (1)ART1、VEGF、bFGF及整合素αVβ3在人大腸癌組織中的表達(dá)及其與腫瘤微血管密度的關(guān)系
  與正常對照組比較,A

11、RT1、VEGF、bFGF及整合素αVβ3在人大腸癌組織中的表達(dá)明顯增高,且ART1與VEGF、bFGF及整合素αVβ3的表達(dá)呈正相關(guān)( P<0.05)。ART1/VEGF,ART1/bFGF,ART1/整合素αVβ3共表達(dá)的人大腸癌微血管密度與非共表達(dá)組相比明顯增高(P<0.05)。
 ?。?)MIBG對人大腸癌LOVO細(xì)胞VEGF、bFGF及整合素αVβ3表達(dá)的影響
  與常規(guī)培養(yǎng)的對照組LOVO細(xì)胞相比,加入ART1特

12、異性抑制劑MIBG后,LOVO細(xì)胞中VEGF、bFGF及整合素αVβ3血管生成相關(guān)因子表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱,陽性表達(dá)細(xì)胞百分比減少(P<0.05)。
  2.離體和在體研究中,ART1對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及微血管形成的影響
  (1) ART1特異性抑制劑MIBG對VEGF及bFGF誘導(dǎo)的HUVECs增殖、遷移及血管形成能力的影響
  與常規(guī)培養(yǎng)的對照組相比,VEGF及bFGF誘導(dǎo)的HUVECs增殖、遷移速度和血管形成

13、能力均明顯增強(qiáng)(P<0.05),但加入ART1特異性抑制劑MIBG后,HUVECs增殖、遷移能力和血管形成能力則明顯減弱(P<0.05)。
  (2) ART1基因沉默及高表達(dá)的大腸癌LOVO細(xì)胞VEGF及bFGF的表達(dá)及其對HUVECs增殖、遷移和血管形成能力的影響
  與Untreated組及LV-control組相比,ART1-shRNA組LOVO細(xì)胞VEGF及 bFGF免疫熒光表達(dá)明顯減弱,陽性細(xì)胞百分比明顯減少,

14、ART1-cDNA組則相反(P<0.05);加入ART1-shRNA組LOVO細(xì)胞上清液的HUVECs增殖活力明顯減弱(P<0.05),而加入ART1-cDNA組LOVO細(xì)胞上清液的HUVECs增殖活力明顯增強(qiáng)(P<0.05),且加入上清液越多,差別越大。
  在用transwell小室建立的LOVO細(xì)胞與HUVECs共培養(yǎng)系統(tǒng)中,與ART1-shRNA組LOVO細(xì)胞共培養(yǎng)的HUVECs遷移速度及體外微血管形成長度均明顯低于Unt

15、reated組及LV-control組(P<0.05);而與ART1-cDNA組LOVO細(xì)胞共培養(yǎng)的HUVECs遷移速度及體外微血管長度均明顯高于Untreated組及LV-control組(P<0.05)。
 ?。?)在體研究中,ART1對小鼠移植瘤微血管形成的影響
  在小鼠脾臟移植瘤模型中,ART1-shRNA組形成的移植瘤微血管密度明顯低于Untreated組及LV-control組(P<0.05),ART1-cDN

16、A組移植瘤微血管密度明顯高于Untreated組及LV-control組(P<0.05)。
  3、ART1影響大腸癌微血管形成可能機(jī)制的初步研究
  (1)ART1對與各族大腸癌LOVO細(xì)胞共培養(yǎng)的HUVECs血管形成影響可能機(jī)制的初步研究
  與Untreated組及LV-control組比較,ART1-cDNA組LOVO細(xì)胞p-Akt、HIF-1a、VEGF及bFGF的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05),ART1-sh

17、RNA組LOVO細(xì)胞各蛋白的表達(dá)則明顯減弱(P<0.05);在對小鼠CT26移植瘤的蛋白檢測中也觀察到,ART1-cDNA組 CT26細(xì)胞 p-Akt, HIF-1a,VEGF, bFGF的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05),ART1-shRNA組則減弱(P<0.05),t-Akt的表達(dá)與Untreated組及LV-control組相比未見明顯差別(P>0.05)。
 ?。?)ART1對VEGF及bFGF誘導(dǎo)的HUVECs血管形成影響可能機(jī)

18、制的初步研究
  與常規(guī)培養(yǎng)的對照組相比,VEGF及 bFGF誘導(dǎo)的 HUVECs中RhoA、P- ROCK1及 P-FAK的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05),而當(dāng)加入ART1特異性抑制劑MIBG后,HUVECs中RhoA、P-ROCK1及P-FAK的表達(dá)明顯減弱(P<0.05);而t-ROCK1及t-FAK的表達(dá)與對照組相比未見明顯差別(P>0.05)。
  結(jié)論:
  1、在大腸癌組織和細(xì)胞中存在ART1的高表達(dá),且與

19、血管生成相關(guān)因子VEGF、bFGF及整合素αVβ3的表達(dá)呈正相關(guān);ART1/VEGF, ART1/bFGF, ART1/整合素αVβ3共表達(dá)與腫瘤微血管密度呈正相關(guān);ART1特異競爭性抑制劑MIBG可以明顯抑制LOVO細(xì)胞中VEGF、bFGF及整合素αVβ3的表達(dá),提示ART1可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞VEGF、bFGF及整合素αVβ3的表達(dá),并與腫瘤微血管形成有關(guān)。
  2. ART1特異競爭性抑制劑MIBG可明顯抑制由VEGF及bFGF

20、誘導(dǎo)的HUVECs的增殖、遷移及血管形成能力,且ART1-cDNA組LOVO細(xì)胞VEGF和bFGF表達(dá)陽性細(xì)胞百分比均增加,其細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以明顯促進(jìn)HUVECs增殖,與之共培養(yǎng)的HUVECs遷移能力及血管形成能力均明顯增強(qiáng),ART1-shRNA組結(jié)果相反。ART1-cDNA組的CT26細(xì)胞形成的小鼠移植瘤MVD明顯增高,ART1-shRNA組則相反。以上結(jié)果提示ART1可促進(jìn)VEGF及bFGF的釋放,并可能通過參與HUVECs增殖、

21、運(yùn)動及血管形成能力的調(diào)節(jié),促進(jìn)腫瘤血管形成。
  3.在LOVO細(xì)胞中,ART1-cDNA組細(xì)胞p-Akt、HIF-1a、VEGF及bFGF的表達(dá)明顯增強(qiáng),ART1基因沉默組結(jié)果相反。提示ART1可能通過促進(jìn)Akt的磷酸化,上調(diào)HIF-1a的表達(dá),在腫瘤細(xì)胞中增加VEGF、bFGF的表達(dá)與分泌,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤微血管的生成。
  在VEGF/bFGF誘導(dǎo)的HUVECs中,ART1特異性抑制劑MIBG明顯抑制HUVECs中RhoA

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