MALAT1靶基因AKAP9在大腸癌的表達及其調(diào)控機制的初步研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發(fā)性肝癌，其發(fā)生率在我國有明顯增加趨勢。近些年來，雖然隨著診療新技術的應用和化療藥物的不斷更新，結(jié)直腸癌患者的預后得到了極大地改善，但是患者總的生存率并沒有得到顯著提高，主要原因是多數(shù)結(jié)直腸癌患者在行根治性手術前已出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移。我們前期研究證實長非編碼RNA基因MALAT1(metastasis associatedlung adenocarcin

2、oma transcript1)即肺轉(zhuǎn)移相關轉(zhuǎn)錄本1與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移關系十分密切，并且長非編碼RNA基因MALAT1可通過調(diào)控轉(zhuǎn)移相關靶基因在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中起重要作用，其中AKAP9(A型激酶錨定蛋白9)基因是受MALAT1基因調(diào)控的重要靶基因之一。AKAP9是AKAPS家族中的一員。AKAP9蛋白定位于中心體、高爾基體等部位AKAP9基因定位于染色體7q21-q22，全長169.81Kb。AKAP9編碼基因中的1-8外顯子通過選擇性剪接

3、能產(chǎn)生多種異構(gòu)體，其中包括AKAP450、AKAP350、AKAP120和Yotiao等，Yotiao是AKAPS家族中的功能最活躍的一員，能激活PKA促進Actin的表達。AKAP9與結(jié)直腸癌發(fā)病關系的研究尚處于起步階段，關于AKAP9與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的研究，國內(nèi)外還未見文獻報道。MALAT1調(diào)控AKAP9的機制以及AKAP9在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用還不清楚。已有研究表明MALAT1可以通過調(diào)控細胞內(nèi)SR蛋白而調(diào)控相關基因的可變剪接，因此我們

4、提出MALAT1通過調(diào)控SR蛋白并激活AKAP9-PKA-EMT信號通路促進結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的研究設想。本研究分為三個部分：
　　 第一部分：AKAP9在結(jié)直腸癌細胞中的表達。運用real-time PCR、和Western blot方法在基因和蛋白水平檢測AKAP9在8種結(jié)直腸癌細胞株中的表達;同時應用細胞免疫化學S-P法，檢測8株結(jié)直腸癌細胞中AKAP9蛋白的表達情況。real-time PCR和Western blot檢

5、測了8種結(jié)直腸癌細胞株中AKAP9的表達，結(jié)果表明，real-time PCR和Western blot檢測的結(jié)果比較一致。8株細胞中AKAP9均有表達，在高轉(zhuǎn)移的LOVO、SW620中表達較強，在由南方醫(yī)科大學病理科自建的具有高選擇肝臟轉(zhuǎn)移特性的SW480亞系SW480/M5細胞株中表達也較高，在結(jié)腸癌原發(fā)癌建系的SW480、HCT116、DLD1細胞株中為中低度表達，綜上，AKAP9在轉(zhuǎn)移性較高的結(jié)直腸癌細胞中表達明顯高于無轉(zhuǎn)移性或

6、低轉(zhuǎn)移性大腸癌細胞。細胞免疫化學檢測AKAP9蛋白在結(jié)直腸癌細胞中的表達，結(jié)果表明:AKAP9蛋白表達的陽性信號定位于細胞漿內(nèi)，在HCT116，SW480，DLD1細胞株中，基本上是陰性表達，而在LOVO，HT29，LSI74T, SW620，M5中，AKAP9在這5株細胞中明顯表達高于HCT116，SW480，DLD1。
　　 第二部分：AKAP9在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義。收集南方醫(yī)院普外科54例新鮮結(jié)直腸癌組織和切緣

7、正常粘膜組織（距癌變邊緣10cm），手術切除后立即置于液氮中，常規(guī)-80℃冰箱凍存。進行realtime-PCR反應結(jié)果顯示:配對結(jié)直腸癌組織中AKAP9基因在癌組織中比正常組織中表達高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)其中AKAP9的表達與患者的年齡，性別，癌的分化程度無關，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.751，0.328，0.953)但與患者的轉(zhuǎn)移情況有關，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007)。同時收集南方醫(yī)院病理科存檔113例結(jié)直腸癌

8、蠟塊，所有標本均由資深病理專家閱片確診，將蠟塊做2um連續(xù)切片，免疫組化采用常規(guī)SP試劑盒檢測不同分化程度原發(fā)部位結(jié)直腸癌及相應正常結(jié)直腸粘膜組織中AKAP9蛋白，發(fā)現(xiàn)其與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的相關性。結(jié)果表明:AKAP9蛋白表達的陽性信號定位于細胞漿內(nèi)，在正常結(jié)直腸粘膜組織內(nèi)，基本上是陰性表達，在高、中、低分化的結(jié)直腸癌組織里，均有表達，AKAP9在癌組織中的表達高于正常組織。AKAP9表達的高低與病人的性別、腫瘤的分化程度沒有顯著性(P＞0

9、.05)，但是AKAP9表達的高低與腫瘤的浸潤程度差別具有顯著性(P＜0.05)，AKAP9蛋白表達與結(jié)直腸癌的浸潤程度高度相關，即AKAP9表達越高，結(jié)直腸癌浸潤程度就越高。
　　 第三部分：MALAT1對結(jié)直腸癌細胞SR蛋白及AKAP9的調(diào)控作用初步分析。利用課題組前期建立的MALAT1核心功能區(qū)過表達載體pEGFP-C1-MALAT1/fgf已及pGPU6/GFP/NeoshRNA干擾載體，建立MALAT1核心功能區(qū)穩(wěn)定的

10、過表達細胞株和穩(wěn)定干擾的細胞株。采用RNA-FISH聯(lián)合免疫熒光檢測MALAT1與SR蛋白在結(jié)直腸癌細胞中的表達，結(jié)果表明:MALAT1過表達穩(wěn)定細胞株MALAT1-SW480-RNAa細胞中MALAT1 mRNA表達量高，紅色信號比較強，并且定位于細胞核，且與SR蛋白共定位比較多，與過表達穩(wěn)定細胞株MALAT1-SW480-RNAa相比，穩(wěn)定干擾細胞株MALAT1-SW480-RNAi紅色信號比較弱，MALAT1 mRNA表達量低，與

11、SR蛋白共定位比較少。通過RNA-IP檢測MALAT1與SR蛋白在結(jié)直腸癌細胞中結(jié)合和表達。結(jié)果表明:MALAT1-SW480-NC-SRSF1-IP對照組、MALAT1-SW480-RNAi-SRSF1-IP實驗組、MALAT1-SW480-RNAa-SRSF1-IP實驗組三組的MALAT1與SR蛋白結(jié)合的m RNA差異顯著(F=93.472，P＜0.001)。MALAT1-SW480-RNAa-SRSF1-IP實驗組的MALAT1與

12、SR蛋白結(jié)合的mRNA表達最高。采用熒光定量PCR和Western blot檢測MALAT1與AKAP9的關系，結(jié)果表明:結(jié)果表明Western blot的結(jié)果與熒光定量PCR得出的結(jié)果較為一致，在AKAP9在MALAT1-SW480-RMAa細胞表達較高，在MALAT1-SW480-RMAi表達較低。AKAP9在大腸癌細胞與大腸癌組織中均有表達，AKAP9的表達與大腸癌的浸潤和轉(zhuǎn)移相關;MALAT1基因可能通過調(diào)控SR蛋白調(diào)節(jié)AKAP