EMT及其相關因素與大腸癌轉移關系的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 大腸癌是一種常見的惡性腫瘤,嚴重威脅著人類的健康,其發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢。轉移是癌癥治療中的難點,乃患者死亡的主要因為,因此探討大腸癌轉移的分子機制,尋找有效的預防和治療途徑是大腸癌研究的重要內容。
　　 上皮細胞間質轉化態(tài)(epithelial-mesenchymal transition,EMT),是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間充質細胞轉分化的現(xiàn)象,目前EMT被看成導致腫瘤進展的病理過程

2、,與侵襲和轉移有關系。在EMT的過程中,細胞之間的粘附減少,上皮細胞極性喪失,與周圍基質細胞的接觸減少,細胞遷移和運動能力增強,同時細胞表型發(fā)生改變,喪失上皮表型,如角蛋白絲,E-鈣粘素(E-cadherin),而獲得間質表型,如波形蛋白(Vimentin),纖維連接蛋白,N-鈣粘素,α-SMA等。其中E-cadherin水平的下降可以導致細胞的粘附力降低,使細胞獲得易于侵襲和轉移的特性,E-cadherin表達的丟失已經被認為是EMT

3、最顯著的特征。目前認為EMT的發(fā)生過程是由精確的細胞內信號轉導機制調控,由微環(huán)境因子作用于細胞表面特異性受體,將信號轉入細胞內,誘導細胞通路的改變,最終導致基因表達的改變。
　　 Tiaml基因(T lymphoma invasion and metastasis)是從鼠T淋巴瘤中克隆出來的基因,全稱T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1。Tiaml幾乎在所有的腫瘤細胞中都表達,但表達水平根據(jù)腫瘤細胞侵襲轉移能力的不同而不同。其在肺癌、乳腺

4、癌、卵巢癌、喉癌、結腸癌等多種惡性腫瘤組織中呈陽性表達并與侵襲轉移密切相關。Tiaml對于控制細胞形態(tài)、粘附和運動以及信號傳導都有重要作用,并能夠誘導腫瘤細胞的侵襲轉移。
　　 文獻報道結腸癌中高表達Tiaml的細胞也高表達Vimentin,具有更多的轉移表型,同時E-cadherin的表達減少。本課題組前期通過免疫組化檢測大腸癌組織中Tiaml與EMT標志物的表達,顯示Tiaml的表達與上皮表型標志物E-cadherin、CK

5、呈正相關,而與間質標志Vimentin呈負相關。證實Tiaml與大腸癌的分化和轉移有關,其促進大腸癌轉移的機制可能與EMT發(fā)生有關。并且發(fā)現(xiàn)Tiaml基因表達沉默可逆轉Lovo細胞的EMT表型,同時其侵襲轉移的能力減弱。那么對于不同轉移能力的大腸癌細胞,Tiaml與EMT標記物的表達情況怎樣?兩者又有何關系?將在本研究中探討。
　　 TGF-β1是一種具有多種生物學活性的多肽生長因子,可影響腫瘤細胞的形態(tài),改變其運動及侵襲能力,

6、并能誘導大腸癌細胞發(fā)生EMT,此過程由諸多細胞因子和蛋白一起參與,共同調節(jié)。MMP-2的主要作用是降解細胞外基質,與腫瘤EMT的發(fā)生密切相關,影響腫瘤細胞的增值和遷移等行為。由此可見Tiaml、TGF-β1和MMP-2促進腫瘤侵襲轉移都與EMT的發(fā)生有關,那么它們之間是否有關聯(lián)?需進一步研究證實。
　　 近年有文獻報道EMT與非EMT細胞是共同完成自發(fā)轉移的過程,EMT細胞通過降解細胞周圍基質和血管壁,為非EMT細胞的侵襲轉移鋪

7、平道路。此觀點與以往認為的發(fā)生EMT的腫瘤細胞,其遷移能力比非EMT細胞強有不同之處。那么在大腸癌中發(fā)生EMT的細胞和非EMT細胞之間是否也存在這樣的協(xié)同關系呢?
　　 本研究將重點從以上三個方面探討EMT及其相關因素Tiaml、TGF-β1和MMP-2與大腸癌轉移的關系,初步探討EMT及非EMT的細胞在大腸癌侵襲轉移中的作用。
　　 目的：
　　 1、檢測不同轉移能力的大腸癌細胞系中Tiaml與EMT標記物的表

8、達并分析兩者之間的關系。
　　 2、探討Tiaml、TGF-β1和MMP-2在大腸癌EMT中的關系。
　　 3、探討EMT及非EMT的細胞在大腸癌侵襲轉移中的作用。
　　 方法
　　 1、用Real time-RT PCR法分析Tiaml mRNA,E-cadherin mRNA和VimentinmRNA在6種大腸癌細胞系中的表達情況；通過免疫組化檢測Tiaml,E-cadherin和Vimentin在L

9、oVo和HT29中的表達；通過考馬斯亮藍染色觀察LoVo和HT29的細胞骨架。
　　 2、免疫組化檢測:應用免疫組化二步法,檢測23例大腸正常組織、85例大腸癌和28例淋巴結轉移癌中TGF-β1和MMP-2的表達,結合本課題組前期實驗Tiaml和E-cadherin在人大腸癌組織中表達的結果,探討Tiaml與TGF-β1,MMP-2在大腸癌EMT中的關系。
　　 3、使用TGF-β1長期誘導大腸癌HT29細胞；應用熒光定

10、量PCR檢測誘導前后細胞的Tiaml mRNA、E-cadherin mRNA和Vimentin mRNA的表達；HE染色觀察細胞形態(tài)；考馬斯亮藍染色觀察細胞骨架；劃痕實驗觀察刺激前、刺激后及兩者混合培養(yǎng)后細胞的遷移運動情況。將綠色和紅色熒光蛋白質粒分別轉染發(fā)生EMT的HT29/TGF-β1和非EMT的HT29細胞,使之分別標記上綠光和紅光,兩者混合培養(yǎng),進行劃痕實驗,觀察兩種細胞的運動情況。
　　 結論
　　 1、部分