跨膜4超家族成員9與大腸癌轉移關系的研究.pdf

1、本研究試圖用基因芯片技術篩選三株具有不同轉移潛能的結腸癌細胞株的差異表達基因，從中挑選出有可能影響腫瘤轉移的基因作為研究對象，從分子和細胞水平深入探討該基因對結腸癌細胞轉移能力的影響，旨在研究對大腸癌轉移相關基因，不僅有利于闡明大腸癌轉移的分子機制，而且還能為臨床上預測轉移、基因治療和預后判斷尋找新的有效靶點。 一、基因芯片技術篩選三株具不同轉移潛能的結腸癌細胞株的差異表達基因，確定研究目的基因，驗證基因芯片檢查結果 1

2、、確定三個細胞株轉移能力的差異用異質粘附實驗和趨化運動實驗確定LST、SW480和Lovo三個細胞株之間轉移能力的差異。 2、基因芯片以一對樣本的信號平均值＞2或個＜2而另個＞10；信號值變異系數(shù)＜0.33；信號平均值有2倍以上表達差異作為判定基因差異表達的標準。在明顯表達上調的基因中與轉移相關的基因有：發(fā)動蛋白2、ADP-核糖基化因子1。在明顯下調表達的基因中，與轉移有關系的有跨膜4超家族成員9，又稱四分子交聯(lián)體5。TM4SF

3、9在結腸癌中的表達，為本研究首次報道，選擇該基因作為研究對象。 3、基因水平驗證基因芯片結果用半定量RT-PCR技術，結果顯示TM4SF9mRNA在三個細胞株中的表達水平差異與基因芯片檢測結果相符。 4、蛋白水平驗證基因芯片結果細胞免疫組化技術定性，免疫印跡技術、免疫熒光技術結合流式細胞儀技術定量研究。結果顯示TM4SF9蛋白表達水平差異與基因芯片檢測結果相符。 5、組織定位研究：臨床結腸癌及癌旁正常組織免疫組化

4、研究表明，TM4SF9定位在結腸粘膜細胞的細胞膜上，結腸癌細胞表達明顯強于正常結腸粘膜細胞。 二、體外實驗觀察改變TM4SF9表達水平對結腸癌細胞株轉移相關生物學行為的影響 1、克隆Lovo細胞TM4SF9基因，轉染LST細胞，構建穩(wěn)定表達細胞系構建TM4SF9.pEGFP-C1重組質粒，用Lipofectamine2000TM.轉染入LST細胞，同時轉染pEGFP-C1質粒做對照。 2、RNAi下調Lovo細胞

5、TM4SF9表達設計siRNA片段，用化學合成法合成，用Lipofectamine2000TM導入Lovo細胞中，干擾TM4SF9表達。流式細胞儀及免疫蛋白印跡檢測證明干擾成功，Lovo細胞TM4SF9蛋白表達水平明顯下降。 3、異質粘附實驗實驗結果顯示：改變TM4SF9表達水平后，細胞粘附能力發(fā)生改變，上調TM4SF9表達可增強細胞異質粘附性，下調TM4SF9表達則降低細胞的異質粘附性。 4、趨化運動實驗實驗結果顯示，

6、改變TM4SF9表達水平對結腸癌對運動性影響無顯著性意義。 結論： 1、LST、SW480及Lovo細胞株具有不同轉移潛能，Lovo＞SW480＞LST。 2、LST、SW480、Lovo細胞TM4SF9表達水平有差異，Lovo＞SW480＞LST。 3、TM4SF9在結腸粘膜細胞膜上有表達，與正常結腸粘膜細胞相比，結腸癌細胞TM4SF9表達明顯增強； 4、改變TM4SF9表達水平可以改變結腸癌細