一種新型Rab-like蛋白mRabL5的多克隆抗體制備及生物學(xué)功能初探.pdf

1、Rab蛋白家族是Ras超家族(包括ras， rho/rac， rab， arf以及ran五大類)中最大的家族，是一類小分子量GTP酶，分子量大都在20～25kDa之間，表達(dá)于從酵母、果蠅、小鼠到人類等各種真核生物中，調(diào)節(jié)細(xì)胞器之間的囊泡運(yùn)輸。其在酵母中稱為YPT/SEC，在高等真核生物中稱為Rab。到目前為止，已有近70多種人類Rab蛋白或Rab-like蛋白編碼基因被克隆和鑒定，其中包括一些剪切體。 細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸是一個(gè)重

2、要而又復(fù)雜的過(guò)程，這就意味著有多種Rab蛋白參與其中的調(diào)節(jié)。對(duì)新型Rab蛋白的研究，必將有助于我們進(jìn)一步了解囊泡運(yùn)輸。本課題所研究的新基因mRabL5(GenBank登錄號(hào)：NM 026073)，編碼一個(gè)預(yù)計(jì)分子量為20.7kDa的新型鼠源Rab-like蛋白。前期實(shí)驗(yàn)分析表明，mRabL5具備Rab蛋白家族的許多保守序列，并具有GTP酶活性。 為了更好地研究 mRabL5在囊泡運(yùn)輸中的作用，我們制備了針對(duì)mRabL5的多克隆

3、抗體，并利用自制的抗體檢測(cè)了mRabL5在小鼠組織中的表達(dá)情況，同時(shí)揭示了mRabL5的亞細(xì)胞定位，初步推測(cè)了其在囊泡運(yùn)輸中的功能，結(jié)果如下： 1、制備了針對(duì)mRabL5特異性較好的多克隆抗體。我們利用谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)融合表達(dá)載體，將mRabL5基因全長(zhǎng)及C端分別重組到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，陽(yáng)性的重組子在大腸桿菌表達(dá)菌株。RoseRa中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后的兩種可溶性融合蛋白用Sepharo

4、se 4B進(jìn)行親和純化。純化后的融合蛋白分別免疫家兔，獲得了多克隆抗血清并經(jīng)G蛋白親和純化。通過(guò)ELISA檢測(cè)，自制的抗體效價(jià)高。westem blot及免疫熒光結(jié)果表明兩種自制的抗體能識(shí)別真核細(xì)胞表達(dá)的mRabL5蛋白，針對(duì)C端制備的抗體具備更好的特異性，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)非特異性信號(hào)少，是后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的理想工具。 2、組織廣譜表達(dá)的mRabL5與反面高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)共定位。通過(guò)westemblot及組織切片免疫熒光實(shí)驗(yàn)，我們?cè)谛∈蟾?/p>

5、主要組織都檢測(cè)到mRabL5的表達(dá)，表明其是一個(gè)廣譜表達(dá)的Rab-like蛋白。利用高爾基復(fù)合體特異性指示探針C<,6>-NBD-Ceramid，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)mRabL5在細(xì)胞內(nèi)聚集于核周一側(cè)的分布形式與高爾基復(fù)合體的亞細(xì)胞定位一致。進(jìn)一步我們用反面高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(TGN)特異性指示探針發(fā)現(xiàn)，Nocodazole處理，能同時(shí)引起TGN與mRabL5亞細(xì)胞定位發(fā)生離散。除去Nocodazole后，兩者恢復(fù)核周一側(cè)聚集的共分

6、布形式。而用兩種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記物：DiOC<,6>、Texas red-labeled ConA，我們沒(méi)有檢測(cè)到mRabL5與之的共定位現(xiàn)象。Lyso Tracker Red標(biāo)記的溶酶體與mRabL5也不呈現(xiàn)共定位。以上結(jié)果提示，作為一種組織廣譜表達(dá)的Rab-like蛋白，mRabL5可能參與調(diào)節(jié)TGN有關(guān)的囊泡運(yùn)輸。 3、mRabL5參與內(nèi)吞途徑。我們通過(guò)超速離心進(jìn)行細(xì)胞組分分餾，發(fā)現(xiàn)mRabL5在細(xì)胞內(nèi)有胞質(zhì)可溶及膜結(jié)合兩種存

7、在形式。加入TRITC-WGA促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞途徑后，mRabL5在可溶性胞質(zhì)及內(nèi)膜系統(tǒng)中的分布比例發(fā)生變化。同時(shí)，通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)，我們檢測(cè)到內(nèi)吞途徑促進(jìn)過(guò)程中，mRabL5與含有WGA結(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)涵體共定位。以上結(jié)果表明，mRab5在細(xì)胞內(nèi)循環(huán)于膜系統(tǒng)和胞質(zhì)之間，參與TRTIC-WGA的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。 綜上所述，我們制備了兩種多克隆抗體，針對(duì)C端的多克隆抗體具有更好的抗原特異性。利用該抗體，我們檢測(cè)到mRabL5是一個(gè)廣譜表達(dá)