miR-375在乙肝相關(guān)性肝癌的疾病進(jìn)程中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌（HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，病程進(jìn)展快，病死率逐年攀升。在我國乙型肝炎病毒（HBV）的感染是HCC最主要的病因之一。HCC早期癥狀隱匿，中、后期治療效果差，預(yù)后不良。迄今為止，靈敏度或特異度不足是HCC診斷標(biāo)志物存在的普遍問題，雖然近年也有一些新的血清學(xué)標(biāo)志物的研究，但在臨床應(yīng)用上仍有一定的局限性，用于對慢性HBV感染發(fā)展到HBV相關(guān)性肝癌的疾病進(jìn)程進(jìn)行預(yù)測就更難以實(shí)現(xiàn)。因此，急需尋找與HBV慢性感染到

2、癌變過程密切相關(guān)的，有較高特異性和敏感性的血清學(xué)標(biāo)志物，并探討其調(diào)控作用。這將有助于臨床上HCC患者的早期發(fā)現(xiàn)和治療，并對改善肝癌患者的預(yù)后，提高生存率具有重要意義。
　　microRNAs（miRNAs）是一類長度約22nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA小分子，可以對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn) miR-375在各種惡性腫瘤中呈低表達(dá)，它的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。miR-375對肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲有抑制作用，但缺乏進(jìn)一步

3、的流行病學(xué)現(xiàn)場研究來分析miR-375在健康人群、HBV慢性感染者、肝硬化到HBV相關(guān)性肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的表達(dá)水平；血清中和肝癌組織中miR-375的差異表達(dá)與患者HBV血清標(biāo)志物、肝癌相關(guān)的臨床檢測指標(biāo)等的相關(guān)性如何也未見報(bào)道。因此，本研究以現(xiàn)場研究和實(shí)驗(yàn)室研究相結(jié)合，檢測從健康人群、慢性乙肝感染、肝硬化發(fā)展到乙肝相關(guān)肝癌進(jìn)程中血清 miR-375的差異表達(dá)，分析血清和肝癌組織中miR-375表達(dá)水平與疾病進(jìn)展、肝癌臨床檢測指標(biāo)、

4、HBV感染相關(guān)指標(biāo)等的相關(guān)性；同時(shí)在HepG2細(xì)胞平臺上，通過miR-375增強(qiáng)表達(dá)探討其對肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。本研究將進(jìn)一步闡明肝癌發(fā)展的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為肝癌的疾病進(jìn)展的預(yù)測提供線索。
　　【方法】
　　1.人群肝癌組織實(shí)驗(yàn)部分：于2014年8月至2015年8月在西京醫(yī)院收集進(jìn)行手術(shù)治療的HBsAg陽性HCC患者為研究對象，采集患者肝癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用自行設(shè)計(jì)調(diào)查表收集研究對象人口學(xué)信息和臨床資

5、料，通過 qRT-PCR對組織miR-375進(jìn)行檢測，使用ELISA法檢測乙肝五項(xiàng)。分析比較肝癌組織與癌旁正常組織miR-375表達(dá)水平的差異，以及肝癌組織miR-375表達(dá)水平與腫瘤分期、大小、數(shù)目、常用腫瘤標(biāo)志物以及HBV血清標(biāo)志物等之間的相關(guān)性。
　　2.人群血清研究部分：2014年10月至2015年2月，在唐都醫(yī)院感染科收集HBV相關(guān)性疾病患者；同期于第四軍醫(yī)大學(xué)校直門診部收集健康對照；并且將第一部分HBV相關(guān)性HCC患者

6、的血清學(xué)標(biāo)本也納入研究。采集血液標(biāo)本，使用統(tǒng)一調(diào)查表收集基本信息和臨床資料，通過qRT-PCR檢測miR-375和HBV DNA，使用ELISA法檢測乙肝五項(xiàng)。比較健康對照、慢性乙型肝炎無肝硬化患者、肝硬化患者以及HBV相關(guān)性肝癌患者的血清miR-375表達(dá)水平的差異，分析其與患者HBV血清標(biāo)志物、肝癌臨床檢測指標(biāo)等的相關(guān)性，并繪制ROC曲線，分析miR-375對HBV相關(guān)性HCC的診斷效能。
　　3.細(xì)胞研究部分：選擇能夠穩(wěn)定復(fù)

7、制 HBV的肝癌細(xì)胞 HepG2.2.15和其親本HepG2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過qRT-PCR檢測兩株肝癌細(xì)胞miR-375表達(dá)水平的差異。利用體外轉(zhuǎn)染 miR-375 mimic上調(diào)其表達(dá)，采用 CCK-8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell實(shí)驗(yàn)分析miR-375的過表達(dá)對HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Epidata3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資

8、料使用t檢驗(yàn)、方差分析或Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性使用Spearman相關(guān)性分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　【結(jié)果】
　　1.人群肝癌組織實(shí)驗(yàn)部分：納入HBV相關(guān)性HCC研究對象43例，腫瘤數(shù)目平均為1.24±0.58個(gè)，腫瘤大小平均為5.99±2.58 cm。
　　①HBV相關(guān)性肝癌患者肝癌組織中miR-375表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（P＜0.001

9、）。
　　②分析肝癌組織miR-375的表達(dá)與HBV血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性結(jié)果顯示：HBV DNA陽性的患者腫瘤組織miR-375的表達(dá)水平顯著低于HBV DNA陰性患者（P＜0.05）；抗-HBc陽性患者肝癌組織中miR-375的表達(dá)水平顯著低于抗-HBc陰性患者的水平（P＜0.001）。
　?、鄹伟┙M織miR-375的表達(dá)與HCC患者臨床特征分析結(jié)果顯示：男性患者肝癌組織miR-375的表達(dá)水平顯著低于女性患者（P＜0.0

10、5）；存在肝硬化的HCC患者肝癌組織miR-375的表達(dá)水平顯著低于無肝硬化的HCC患者（P＜0.05）；CA19-9出現(xiàn)升高的HCC患者肝癌組織中miR-375的表達(dá)水平顯著低于CA19-9正常的患者（P＜0.05）。
　　2.人群血清研究部分：納入研究對象177例，其中健康對照40例，慢性乙型肝炎無肝硬化患者20例，HBV肝硬化患者54例，HBV相關(guān)性HCC患者63例。
　?、俳】等巳貉逯衜iR-375的表達(dá)量最高，而

11、慢性乙型肝炎無肝硬化患者、肝硬化患者和HCC患者的血清miR-375水平依次降低。
　　②分析血清miR-375的表達(dá)與HBV血清學(xué)標(biāo)志物的相關(guān)性結(jié)果顯示：血清miR-375在HBeAg陽性患者中的表達(dá)水平顯著低于陰性患者（P＜0.05）；抗-HBe陰性患者血清miR-375表達(dá)水平顯著高于抗-HBe陽性的患者（P＜0.05）；血清miR-375在HBV DNA陽性患者中的表達(dá)水平顯著低于HBV DNA陰性的表達(dá)水平（P＜0.05

12、）。
　　③分析血清miR-375的表達(dá)水平與HBV相關(guān)性患者腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性，結(jié)果顯示：血清miR-375在AFP和CEA陽性患者中表達(dá)水平均低于陰性患者（P＜0.05）。
　?、芾L制ROC曲線，結(jié)果顯示：miR-375從全部研究對象中診斷出HBV相關(guān)性HCC患者的靈敏度為73.9％，特異度為93.0%， AUC為0.838（95%CI：0.780~0.897）；分別使用miR-375和AFP從HBV相關(guān)性疾病患者中診斷

13、出HCC患者，前者靈敏度為93.8%，特異度為63.9%，AUC為0.768（95%CI：0.644~0.891），后者靈敏度為75.0%，特異度為65.5%，AUC為0.584（95%CI：0.456~0.713）。
　　3.細(xì)胞研究部分：
　?、倥cHepG2細(xì)胞相比，miR-375在表達(dá)HBV全基因組的HepG2.2.15細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)（P＜0.05）。
　?、贑CK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：細(xì)胞miR-375過表達(dá)后的

14、增殖速度小于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞的增殖速度均小于轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞。
　?、蹌澓蹖?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，未轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞出現(xiàn)遷移現(xiàn)象；轉(zhuǎn)染后的HepG2.2.15細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，貼壁能力比轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞弱。
　?、躎ranswell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-375的細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯少于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；分析轉(zhuǎn)染后的HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞侵襲數(shù)目，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)

15、后，HepG2細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目高于HepG2.2.15細(xì)胞。
　　【結(jié)論】
　　1.HBV相關(guān)性HCC患者腫瘤組織中miR-375的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，腫瘤組織miR-375的表達(dá)水平與抗-HBc以及HBV DNA滴度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　2.健康對照者血清miR-375的表達(dá)水平最高，隨著HBV相關(guān)疾病進(jìn)程的發(fā)展，血清miR-375的表達(dá)水平逐漸降低，在HBV相關(guān)性HCC患者血清中達(dá)到最低水平，這將為肝癌的疾病進(jìn)

16、展的預(yù)測提供重要線索。血清miR-375的表達(dá)水平與HBeAg、抗-HBe、HBV DNA、AFP以及CEA存在相關(guān)性。
　　3.血清miR-375可以作為肝癌的輔助診斷指標(biāo)，對HBV相關(guān)性HCC患者的檢出具有較高靈敏度和特異度。
　　4.與HepG2細(xì)胞相比，miR-375在HepG2.2.15細(xì)胞中呈下調(diào)表達(dá)。通過體外miR-375的增強(qiáng)表達(dá)，miR-375能夠有效地影響HBV的復(fù)制，并抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，