基于等溫雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的沙門(mén)氏菌可視化檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、食品貿(mào)易作為國(guó)際貿(mào)易的主要組成部分，在擴(kuò)大出口創(chuàng)匯、解決糧食供求矛盾的同時(shí)，也帶來(lái)了食源性疾病的發(fā)病率和死亡率上升的問(wèn)題。微生物病原是我國(guó)食源性疾病的主要病因，占30％~40%，細(xì)菌占微生物病原的81.5%。因此，食源性疾病尤其是由細(xì)菌污染引起的食源性疾病是我國(guó)食品安全面臨的首要問(wèn)題。我國(guó)作為一個(gè)食品生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，建立快速、準(zhǔn)確的食源性病原菌檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于食品質(zhì)量監(jiān)控、保證人民健康至關(guān)重要。
　　目前食源性細(xì)菌檢測(cè)的方法主要有三

2、大類：平皿培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測(cè)以及現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)方法。平皿培養(yǎng)法使用的是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)儀器并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，但是檢測(cè)周期較長(zhǎng)，5~7天，而且程序繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。經(jīng)典的酶連免疫吸附技術(shù)（ELISA）等免疫學(xué)檢測(cè)方法，特異性高、靈敏性高，但是需要多種蛋白質(zhì)分子（如單克隆抗體）的參與，成本較高，而且對(duì)反應(yīng)環(huán)境要求苛刻。新型免疫熒光技術(shù)也具有對(duì)試劑、儀器選擇性高的缺點(diǎn)。分子生物學(xué)方法針對(duì)的靶標(biāo)是核酸，但是由于生物體內(nèi)核酸的含量

3、通常是十分微少的，因此經(jīng)過(guò)溫度循環(huán)的核酸擴(kuò)增如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)定量PCR幾乎是這類檢測(cè)方法的前提步驟。但是對(duì)于落后地區(qū)或者設(shè)備資源貧乏的環(huán)境，這些檢測(cè)方法也受到限制。
　　雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）是一種無(wú)酶參與、室溫條件便可以進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。相對(duì)于PCR，HCR并不是對(duì)于模板序列的直接擴(kuò)增，而是間接的對(duì)核酸信號(hào)進(jìn)行放大。由于具有無(wú)酶參與，反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，近年來(lái)，HCR反應(yīng)與電化學(xué)、熒光信號(hào)技術(shù)結(jié)合已經(jīng)被廣泛應(yīng)用

4、于核酸、蛋白、病原菌等靶標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。可視化檢測(cè)技術(shù)，是指檢測(cè)的結(jié)果可以在可見(jiàn)光或者紫外燈下被肉眼觀察的實(shí)驗(yàn)方法。相對(duì)于其他檢測(cè)方法，因?yàn)椴恍枰軆x器參與，因此檢測(cè)成本較低，適用場(chǎng)合較廣。
　　本實(shí)驗(yàn)的目的是以核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)HCR作為信號(hào)放大手段，以腸炎沙門(mén)氏菌為檢測(cè)靶標(biāo)，建立快速、低成本的檢測(cè)方法。我們利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast比對(duì)功能篩選出腸炎沙門(mén)氏菌核糖體16S rRNA特異性片段作為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性的抓取探針

5、、檢測(cè)探針，并以HCR反應(yīng)作為信號(hào)放大手段，分別結(jié)合膠體金免疫層析試紙條、微孔板顯色這兩種方法建立低成本、快速便捷的即時(shí)診斷技術(shù)（POCT）。
　　在膠體金免疫層析試紙條方法中，我們首先制備了檢測(cè)試紙條：納米金顆粒上包被有鏈霉親和素、檢測(cè)線上涂有熒光基團(tuán)的抗體，質(zhì)控線上涂有生物素。然后以合成的模擬靶標(biāo)建立檢測(cè)模型，并進(jìn)行相應(yīng)的條件優(yōu)化。我們發(fā)現(xiàn)HCR反應(yīng)中最佳啟動(dòng)探針/發(fā)夾探針的濃度比例是1:5，修飾探針/不修飾探針的含量比例是9

6、:1，最佳抓取探針濃度是0.3μM并且能夠區(qū)分靶標(biāo)沙門(mén)氏菌序列與弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、耶爾森氏菌五種細(xì)菌的相似性片段。以合成序列為靶標(biāo)的檢測(cè)模型中，未結(jié)合HCR反應(yīng)的檢測(cè)限是0.31nM，結(jié)合HCR反應(yīng)的方法可以檢測(cè)到1.76pM，放大倍數(shù)為176倍。然后我們將培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)、并提取其總 RNA，結(jié)合本方法進(jìn)行實(shí)際樣本的檢測(cè)，計(jì)算的LOD值為3×103 CFU mL-1。在獲取RNA樣本之后，

7、整個(gè)檢測(cè)時(shí)間在30min之內(nèi)，并且結(jié)果可以用肉眼判斷。
　　在微孔板顯色實(shí)驗(yàn)中，包被由鏈霉親和素的微孔板用于固定具有特異性識(shí)別能力的、修飾有生物素分子的抓取探針。靶標(biāo)序列的存在，使得夾心結(jié)構(gòu)：抓取探針/靶標(biāo)序列/HCR得以形成，并由于生物素與鏈霉親和素之間親合作用被固定到微孔板上，由于HCR產(chǎn)物長(zhǎng)鏈上標(biāo)記有熒光基團(tuán)FITC，可以結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的熒光集團(tuán)抗體anti-FITC-HRP。HRP的存在不僅可以催化顯色反

8、應(yīng)，而且由于自身的高催化活性，達(dá)到雙重信號(hào)放大的能力。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們同樣的進(jìn)行了條件優(yōu)化：最佳抓取探針的濃度是0.5μM，最佳孵育時(shí)是2小時(shí)，anti-FITC-HRP的最佳孵育時(shí)長(zhǎng)是2小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的探針能夠區(qū)分與靶標(biāo)有一個(gè)堿基差異的序列，以合成序列建立檢測(cè)模型的檢測(cè)限是32.6fM。然后我們將培養(yǎng)的沙門(mén)氏菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)、并提取其總RNA，將提取的細(xì)菌RNA用于檢測(cè)，不僅可以將沙門(mén)氏菌與弗氏檸檬酸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌區(qū)分

9、開(kāi)（非靶標(biāo)組的信號(hào)值均不高于22%），而且針對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限可以達(dá)到52.1 CFU mL-1。
　　上述結(jié)果表明，本文所建立的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別結(jié)合免疫層析試紙條、微孔板顯色用于沙門(mén)氏菌可視化檢測(cè)的方法，具有良好的特異性以及靈敏度。相對(duì)于運(yùn)用電化學(xué)、熒光等技術(shù)結(jié)合HCR反應(yīng)的檢測(cè)方法，本文所介紹的兩種實(shí)驗(yàn)方法在檢測(cè)的靈敏性方面并不是最佳的，但是由于本實(shí)驗(yàn)所運(yùn)用的膠體金免疫層析試紙條、微孔板顯色方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都可以用肉眼判斷，不需