基于RNA的PCR技術(shù)對(duì)食品中沙門氏菌與金黃葡萄球菌的檢測(cè).pdf

1、食品微生物是影響食品安全的重要因素，由食源性致病菌引起的病例越來越多。致病菌往往共存于復(fù)雜的生物體系中，且個(gè)體微小、致病性高，因此，微生物檢測(cè)方法必須要高靈敏度、強(qiáng)特異性以及較短的分析時(shí)間。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，需要3~7天的時(shí)間，操作繁瑣，所用試劑復(fù)雜多樣，無法對(duì)微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)而有效的監(jiān)測(cè)和防控；而基于DNA水平的普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)技術(shù)，雖然具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但卻無法區(qū)分死、活細(xì)菌，使得檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)行的致病

2、菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不一致，故普通PCR法只能用來對(duì)已經(jīng)分離培養(yǎng)的致病菌進(jìn)行快速鑒定，而不能對(duì)樣品中的致病菌進(jìn)行直接檢測(cè)。因此，建立一套快速、靈敏又能區(qū)分死、活菌的檢測(cè)方法，尤為重要。
　　本研究選取食品中代表性的致病菌，即革蘭陰性沙門菌(Salmonella)和革蘭陽性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分別以沙門氏菌invAmRNA與金黃色葡萄球菌femA mRNA為檢測(cè)對(duì)象，建立了一套Taqman探針一步實(shí)時(shí)

3、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)法，主要有以下結(jié)論：
　　1)該一步RT-PCR測(cè)法，活菌的檢測(cè)結(jié)果顯陽性，死菌的檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陰性，能夠有效的區(qū)分死、活菌；
　　是否為陽性樣本還可采用以下方法判定：
　　若同一樣本RT-PCR的擴(kuò)增Ct值與PCR的擴(kuò)增Ct值相差大于等于4，則該樣本為陽性；若二者的Ct差值小于4，那么使用DNaseI再消化一次，如果再次消化后，二者的Ct差值大于等于4，那么該樣本為陽性，反之則為

4、陰性；
　　2)菌液在4℃的環(huán)境保存時(shí)，細(xì)菌的代謝活性會(huì)減弱，mRNA的表達(dá)量會(huì)下降，在進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)時(shí)，應(yīng)預(yù)先活化菌液；最佳增菌方式為：50μL菌液添加到3mLLB液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃震蕩培養(yǎng)3h；
　　3)離心柱式試劑盒法所提取的RNA能夠用于RT-PCR對(duì)活菌的檢測(cè)，而傳統(tǒng)TrizolRNA提取法所提取的RNA不適用于RT-PCR對(duì)活菌的檢測(cè)；
　　4)一步法與兩步法RT-PCR在檢測(cè)結(jié)果的C

5、t值上，沒有較為明顯的差異，但一步法耗時(shí)短，易于操作，檢測(cè)成本低，更適合于食源性致病菌的快速檢測(cè)；
　　5)DNA會(huì)干擾RT-PCR對(duì)mRNA的檢測(cè)，RT-PCR檢測(cè)時(shí)，需使用DNaseI除去RNA抽提液中殘留的DNA，才能有效的區(qū)分死、活菌；兩次DNaseI的使用幾乎能去除所有的殘留DNA，是否需再次使用DNaseI的判定方法：在經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，活菌與死菌的Ct值相差大于等于4時(shí)，可認(rèn)為兩者的Ct值存在差異，可再次使用DN

6、aseI消化提取液；否則，重新實(shí)驗(yàn)；
　　6)探針、引物是影響RT-PCR檢測(cè)的重要因素，將直接影響RT-PCR的定量結(jié)果；本文自設(shè)計(jì)的femA引物、探針具有高度的特異性，其RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列與金黃色葡萄球菌femA基因序列同源，相似性達(dá)100％；在DNA定量的準(zhǔn)確性上已經(jīng)接近市售標(biāo)準(zhǔn)試劑盒水平，在靈敏度上已高于市售試劑盒；該引物、探針可用于普通試劑盒的生產(chǎn)；
　　7)該一步RT-PCR檢測(cè)法穩(wěn)定性良好，能夠檢測(cè)到處于

7、VBNC狀態(tài)下的沙門氏菌，具有較強(qiáng)區(qū)分死、活菌的能力；在檢出限、靈敏度上均優(yōu)于現(xiàn)行國(guó)家商檢標(biāo)準(zhǔn)；沙門氏菌：靈敏度為4×103CFU/mL，檢出限可達(dá)1CFU/3mL；最佳擴(kuò)增參數(shù)為：45℃×10min；95℃×15min；94℃×20s，60℃×20s，72℃×20s，40cycles；單點(diǎn)熒光在72℃；選用FAM通道檢測(cè)；金黃色葡萄球菌：靈敏度為9×102CFU/mL，檢出限可達(dá)1/3CFU/3mL；最佳擴(kuò)增參數(shù)為：45℃×10min