超聲微泡靶向介導(dǎo)microRNA-21調(diào)控PDCD4-NF-κB-TNF-α通路防治冠狀動脈微栓塞致心肌損傷機制的研究.pdf

1、冠狀動脈微栓塞（Coronary Microembolization，CME）是急性冠脈綜合征（Acute Coronary Syndrome，ACS）和經(jīng)皮冠狀動脈介入(PercutaneousCoronary Intervention，PCI)治療過程中由于粥樣硬化斑塊碎屑的脫落引起的遠端微血管栓塞的棘手并發(fā)癥，是患者遠期預(yù)后不良和主要心臟不良事件發(fā)生的強烈預(yù)測因子。目前研究表明CME致心功能損傷的機制主要與心肌局部炎癥有關(guān)，尤其與

2、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)密切相關(guān)，但其具體的調(diào)控機制尚不完全清楚。
　　程序性細胞死亡因子4(programmed cell death4，PDCD4)是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，不僅對細胞的程序性死亡進行重要調(diào)節(jié)，而且對于炎癥發(fā)生也有重要作用，Sheedy等報道PDCD4可以促進核因子-κB(nuclearfacotr-κappa B，NF-κB)活化，同時抑制IL-10的上調(diào)，促進炎癥的發(fā)生。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定性心絞

3、痛患者PCI術(shù)后PDCD4表達明顯增加，促使TNF-α分泌增多，介導(dǎo)了PCI術(shù)后心肌的炎癥反應(yīng)。由于CME是PCI治療過程中常見的并發(fā)癥，在預(yù)實驗中我們也發(fā)現(xiàn)CME后豬心肌細胞PDCD4表達水平明顯升高。因此，PDCD4介導(dǎo)的信號通路很有可能參與了CME后心肌炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進而導(dǎo)致心肌損傷。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長約21～25個核苷酸的小分子RNA，廣泛存在于動物、植物、病毒和單個細胞生物體中。miRNA存在

4、于基因組的非編碼區(qū)，是一類重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因，具有調(diào)節(jié)細胞增生、分化、凋亡、炎癥等過程的功能。
　　超聲靶向微泡破裂(ultrasound-targetedmicrobubble destruction，UTMD)是近年來新起的一種高效、安全、具有靶向性的非病毒基因傳輸技術(shù)，可以使目的基因更容易進入組織細胞內(nèi)，實現(xiàn)并增強基因的轉(zhuǎn)染及表達效率。因此，本研究擬經(jīng)導(dǎo)管建立CME豬的動物模型，構(gòu)建microRNA-21真核表達質(zhì)粒，通過

5、超聲微泡靶向介導(dǎo)轉(zhuǎn)染microRNA-21，檢測CME后PDCD4/NF-κB/TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況，以深入闡明microRNA-21防治CME致心肌損傷的效應(yīng)機制。
　　第一部分 冠狀動脈微栓塞致心肌損傷過程中PDCD4的表達及動態(tài)變化
　　目的:本實驗?zāi)康氖峭ㄟ^建立豬的冠狀動脈微栓塞(coronarymicroembolization，CME)模型，觀察CME致心功能損傷與程序性細胞死亡因子4（program

6、med cell death4，PDCD4）表達的動態(tài)變化及關(guān)系。
　　方法:60頭巴馬小豬分為微栓塞組（CME組）、假手術(shù)組（Sham組），每組小豬均為30只;經(jīng)微導(dǎo)管左前降支注入微栓塞球構(gòu)建CME模型組，注射生理鹽水構(gòu)建假手術(shù)組。每組小豬按不同觀察時間點隨機分為0h、3h、6h、9h、12h、24h組（每組小豬均為5頭）。應(yīng)用心臟超聲檢測心功能指標;電化學發(fā)光法(ECL)檢測血清肌鈣蛋白(cTnⅠ)水平;組織病理切片蘇木素-伊

7、紅（HE）染色和蘇木素堿性復(fù)紅苦味酸(HBFP)染色進行梗死區(qū)域測量;熒光定量PCR檢測心肌組織PDCD4與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA表達;Western blotting檢測心肌組織PDCD4與TNF-α蛋白表達。
　　結(jié)果:超聲心動圖參數(shù)顯示，CME組除0h時間點外其余時間點左室射血分數(shù)（LVEF）均較Sham組明顯降低(P＜0.05)，伴隨著LVEF顯著下降，心臟超聲表現(xiàn)為左室短軸縮短率(FS)和心排血量(CO)

8、下降及左室舒張期末徑(LVEDd)增加。血清心肌損傷標志物cTnⅠ在CME后3h開始升高，9h達到高峰，24h開始下降，但仍高于基礎(chǔ)值(P＜0.05)。病理學顯示，CME組3h、6h、9h、12h、24h時間點均可見微梗死灶，但各時間點之間的微梗死面積比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，CME組心肌組織PDCD4與TNF-α mRNA表達都是在3h開始升高，9h達高峰，12h和24h下降(P＜0.05)，
　

9、　結(jié)論:PDCD4參與了CME致心功能的損傷，并呈現(xiàn)出明顯的時間變化規(guī)律，可能是通過調(diào)控心肌TNF-α的表達實現(xiàn)。
　　第二部分 PDCD4/NF-κB/TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在豬冠狀動脈微栓塞致心肌損傷中作用機制的研究
　　目的:冠狀動脈微栓塞(coronary microembolization，CME)是冠狀動脈血栓性病變行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PC

10、I)過程中常見的并發(fā)癥，CME所致的心肌局部炎癥反應(yīng)是引起進行性心功能障礙的主要原因，程序性細胞死亡因子4(programmed cell death4，PDCD4)/核因子-κB（nuclear facotr-κappa B，NF-κB）信號通路在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，但其在CME中的作用尚不清楚，因此本研究探討PDCD4/NF-κB/TNF-α信號通路對小豬CME致心肌炎癥反應(yīng)及心肌損傷的影響。
　　方法:20頭巴馬

11、小豬隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、微栓塞組(CME組)、CME+siRNA-PDCD4組、CME+siRNA-Control組，每組小豬均為5只。經(jīng)微導(dǎo)管左前降支注入微栓塞球構(gòu)建CME模型組，注射等量生理鹽水構(gòu)建Sham組。CME+siRNA-PDCD4組于CME前72h經(jīng)微導(dǎo)管在左前降支注入PDCD4 siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物。CME+siRNA-Control組于CME前72h經(jīng)微導(dǎo)管在左前降支注入等量Control siRNA混合液

12、。應(yīng)用心臟超聲檢測心功能指標;電化學發(fā)光法(ECL)檢測血清肌鈣蛋白(cTnⅠ)水平;組織病理切片HE及HBFP染色進行梗死區(qū)域測量;熒光定量PCR檢測心肌組織PDCD4與腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA表達;Western blotting檢測心肌組織PDCD4與TNF-α蛋白表達;應(yīng)用凝膠電泳遷移率轉(zhuǎn)變分析(EMSA)評價NF-κB活性。
　　結(jié)果:(1)超聲心動圖參數(shù)顯示，與Sham組比較，CME組心功能顯著降低，表現(xiàn)為

13、心肌收縮功能障礙和左室擴張即左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)、心排血量(CO)下降(P＜0.05)以及左室舒張期末徑(LVEDd)增加(P＜0.05);與CME組比較，CME+siRNA-PDCD4組可改善CME導(dǎo)致的心功能損傷，下降血清cTnⅠ水平，表現(xiàn)為LVEF、FS、CO升高(P＜0.05)以及LVEDd減小(P＜0.05)。(2)與Sham組比較，CME組PDCD4與TNF-α的mRNA和蛋白表達量以及NF-κB

14、活性均顯著增加(均P＜0.05);與CME組比較，CME+siRNA-PDCD4組中PDCD4與TNF-α的mRNA和蛋白表達量以及NF-κB活性明顯較低（均P＜0.05）。
　　結(jié)論:PDCD4/NF-κB/TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活是CME致心肌損傷的重要機制，提示抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能成為CME防治的潛在新靶點。
　　第三部分 超聲微泡靶向轉(zhuǎn)染microRNA-21調(diào)控PDCD4/NF-

15、κB/TNF-α通路防治冠狀動脈微栓塞致心肌損傷
　　目的:冠狀動脈微栓塞(coronary microembolization，CME)后導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是引起心肌損傷的主要原因，PDCD4/NF-κB/TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在CME致心肌炎癥反應(yīng)中起到重要的作用，microRNA-21對心肌有保護作用，主要是通過調(diào)控其靶基因PDCD4實現(xiàn)，因此本研究探討超聲微泡靶向轉(zhuǎn)染microRNA-21對CME小豬心功能的影響及其可能機制。

16、
　　方法:20頭巴馬小豬隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、微栓塞組(CME組)、CME+超聲介導(dǎo)基因組、CME+單純基因組，每組小豬均為5只。經(jīng)微導(dǎo)管左前降支注入微栓塞球構(gòu)建CME模型組，注射等量生理鹽水構(gòu)建Sham組。CME+超聲介導(dǎo)基因組于CME前4d經(jīng)耳緣靜脈注入質(zhì)粒-微泡混合液，同時予超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀經(jīng)豬胸壁輻照心肌。CME+單純基因組于CME前4d經(jīng)耳緣靜脈注入質(zhì)粒-微泡混合液，不予超聲輻照。應(yīng)用心臟超聲檢測心功能指標

17、;電化學發(fā)光法(ECL)檢測血清肌鈣蛋白(cTnⅠ)水平;組織病理切片HE及HBFP染色進行梗死區(qū)域測量;冰凍切片熒光顯微鏡評估綠色熒光蛋白(GFP)標記基因表達量;熒光定量PCR檢測心肌組織PDCD4與腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA表達;Western blotting檢測心肌組織PDCD4與TNF-α蛋白表達;應(yīng)用凝膠電泳遷移率轉(zhuǎn)變分析(EMSA)評價NF-κB活性。
　　結(jié)果:(1)與單純基因組相比，超聲介導(dǎo)基因組可使

18、心肌內(nèi)外源基因表達水平提高8倍以上(P＜0.05)。(2)超聲心動圖參數(shù)顯示，與Sham組比較，CME組心功能顯著降低，表現(xiàn)為心肌收縮功能障礙和左室擴張即左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(FS)、心排血量(CO)下降(P＜0.05)以及左室舒張期末徑(LVEDd)增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:超聲微泡靶向轉(zhuǎn)染microRNA-21可以有效的改善CME致心肌損傷，其主要機制是通過抑制PDCD4/NF-κB/TNF-α信號