擬南芥CIPK14和EGY1基因作用于脅迫應(yīng)答和光反應(yīng)中的生化分析.pdf

1、為了了解CIPK14與EGY1基因受環(huán)境因子調(diào)節(jié)的分子機制，本文通過自行構(gòu)建目的基因突變體，以及結(jié)合現(xiàn)有模式植物擬南芥的一系列T—DNA突變體為材料，系統(tǒng)地研究了CIPK14與EGY1基因在脅迫應(yīng)答過程中的作用，及CIPK14基因的鈣調(diào)節(jié)屬性，和EGY1基因在MEP代謝途徑中的調(diào)節(jié)作用。首次探討了CIPK14與EGY1基因受光調(diào)節(jié)和時鐘節(jié)律性表達的特異性，及EGY1基因通過光信號途徑影響擬南芥花青素合成的分子機理。論文的研究結(jié)果如下：

2、 (1)通過分析ABA(100μM)和鹽(300mM)脅迫條件下擬南芥野生型中CIPK14基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)CIPK14的轉(zhuǎn)錄水平在脅迫處理2小時后便迅速增加，并隨處理時間延長而不斷提高，處理6h時即達到峰值。說明CIPK14基因的轉(zhuǎn)錄受到環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)；進一步比較CIPK14T—DNA插入突變體和野生型經(jīng)ABA和鹽處理后一系列脅迫應(yīng)答基因(RA29A，RD29B，RAB18，KIN1/2，DREB1A，DREB2A，SOS2

3、)的表達情況發(fā)現(xiàn)，由于CIPK14基因功能缺失導(dǎo)致這些被檢測脅迫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄水平都不同程度地降低或表達滯后，說明CIPK14基因在脅迫應(yīng)答中起作用；最后比較了在不同濃度滲透劑(NaCl，ABA，sucrose，glucose，fructose，mannatil)處理下的突變體和野生型種子萌發(fā)、根伸長和葉片持水性等性狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIPK14突變體的種子萌發(fā)和根伸長對各種滲透脅迫均敏感，葉片持水能力也因為CIPK14基因功能缺失而減弱，

4、并且ABA合成抑制劑噠草伏(Norflurazon)能部分恢復(fù)突變體對ABA、鹽等脅迫敏感的表型。這一系列生理學(xué)試驗研究進一步證明CIPK14是脅迫應(yīng)答相關(guān)基因。 (2)鈣是植物體內(nèi)常見的脅迫信號傳遞中的第二信使，為了確定CIPK14激酶活性是否受到胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，我們考查了外源鈣(0，0.1，1，10，100 mM)對CIPK14基因表達的影響，研究發(fā)現(xiàn)，CIPK14的轉(zhuǎn)錄受到極端濃度(0，0.1，100 mM)下外源鈣

5、的激活，說明外源鈣能調(diào)節(jié)CIPK14基因的表達；進一步比較CIPK14 T-DNA插入突變體和野生型經(jīng)0.25μM ABA和125 mM鹽處理的同時，再置于不同濃度(0，0.1，1，10，100mM)的外源鈣條件下，脅迫應(yīng)答基因RD24A的表達情況發(fā)現(xiàn)，突變體中RD29A基因的表達與野生型相比受外源鈣的影響明顯減弱，說明CIPK14基因功能缺失導(dǎo)致受鈣調(diào)節(jié)的脅迫相關(guān)基因?qū)ν庠粹}的敏感性下降。后續(xù)的生理學(xué)試驗研究表明，突變體種子萌發(fā)和根伸

6、長與野生型相比對外源鈣不敏感。脅迫條件下用不同濃度的外源鈣(0，0.1，1，10，50mM)處理后，突變體種子的萌發(fā)率仍維持在45～55％之間的范圍內(nèi)，相反，在Ca2+濃度低于1 mM及150 mM NaCl處理下，野生型種子幾乎不萌發(fā)。少數(shù)萌發(fā)的突變體和野生型種子都不能最后成苗。從而更深入地證明CIPK14基因接受鈣信號調(diào)節(jié)，作用于擬南芥ABA和鹽脅迫應(yīng)答信號途徑，并且CIPK14基因在脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中是位于轉(zhuǎn)錄因子(RD29A，R

7、D22等)上游，而位于鈣信號下游。 (3)植物體內(nèi)生物鐘通過調(diào)控節(jié)律的相位來調(diào)節(jié)植物的生理活動。微陣列實驗表明至少有6％的擬南芥基因是節(jié)律性表達的，其中68％的節(jié)律調(diào)控基因都直接對環(huán)境脅迫有響應(yīng)。本實驗首次發(fā)現(xiàn)CIPK14基因表達受到遠紅光的正調(diào)節(jié)，同時其表達具有生物時鐘性，說明CIPK14是一類受光調(diào)節(jié)且表達具有時鐘節(jié)律性的脅迫相關(guān)基因；另外研究發(fā)現(xiàn)，CIPK14突變體種子萌發(fā)受到遠紅光抑制的同時，突變體在遠紅光培養(yǎng)下產(chǎn)生的黃

8、化苗轉(zhuǎn)入白光培養(yǎng)后，其去黃化的速度比phyA滯后15h以上，比col—4滯后5h以上，RT—PCR分析NADPH：原葉綠素酸酯氧化還原酶POR基因的表達顯示，CIPK14基因功能缺失導(dǎo)致POR基因的轉(zhuǎn)錄水平下降。已有研究表明遠紅光通過phyA介導(dǎo)的途徑抑制POR基因的表達從而阻礙擬南芥去黃化，結(jié)合我們的結(jié)果推測CIPK14可能在擬南芥phyA介導(dǎo)的遠紅光抑制去黃化過程中起負調(diào)控作用。 (4)通過分析ABA(100μM)和鹽(30

9、0mM)脅迫條件下擬南芥野生型中EGY1基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)EGY1的轉(zhuǎn)錄水平在脅迫處理3小時后便急速降低。說明EGY1基因的轉(zhuǎn)錄受到環(huán)境脅迫的抑制；但進一步比較EGY1缺失突變體和野生型經(jīng)ABA和鹽處理后一系列脅迫應(yīng)答基因(RD29A，KIN2)的表達情況發(fā)現(xiàn)， EGY1基因功能缺失并不影響這些被檢測基因受脅迫誘導(dǎo)的強度，同時研究發(fā)現(xiàn)EGY1缺失突變體種子萌發(fā)對ABA和鹽脅迫不敏感，說明EGY1可能不直接參與脅迫信號的感知與傳遞，但作

10、為固醇轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白，EGY1可能通過調(diào)節(jié)植物次生代謝途徑中相關(guān)酶的活性，從而影響ABA或其他次生代謝物的積累來對外界環(huán)境脅迫作出應(yīng)答。 (5)本實驗成功篩選得到EGY1基因共抑制突變體。研究發(fā)現(xiàn)EGY1基因的表達抑制導(dǎo)致擬南芥葉綠素合成受阻，并且發(fā)現(xiàn)EGY1功能缺失導(dǎo)致葉綠素合成途徑(MEP)關(guān)鍵酶(DXR、GGPPS1、POR)基因表達減弱，受光調(diào)節(jié)反應(yīng)滯后，說明EGY1可能參與激活葉綠素合成途徑(MEP)相關(guān)酶基因的表達

11、。通過分析擬南芥MVA和MEP兩條次生代謝途徑限速酶抑制劑MEV(0，0.5，5mM)和FSM(0，20，50gM)作用下EGY1基因表達的變化情況，發(fā)現(xiàn)EGY1基因由于這兩條途徑的阻斷表達增加，表達量隨抑制劑濃度的升高而增強。另外用MEP途徑終產(chǎn)物之一GA處理，EGY1的表達與前面ABA及鹽的誘導(dǎo)一致。這兩組實驗進一步支持了我們認為EGY1可能調(diào)節(jié)植物次生代謝途徑相關(guān)酶合成，并受到相關(guān)終產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)的推斷，但這些結(jié)論還需要更深入的實

12、驗證明。 (6)研究還發(fā)現(xiàn)隨著MS培養(yǎng)基中鹽濃度(0，75，100，125mM)的升高，擬南芥植株花青素含量也相應(yīng)增加。但EGY1突變體在相同條件下花青素的含量增加較緩慢，比較黑暗條件下突變體和野生型體內(nèi)花青素合成酶基因(PAL、CHS)受鹽脅迫誘導(dǎo)的情況，發(fā)現(xiàn)兩者并沒有明顯差異，已有研究證明PAL和CHS基因表達受光誘導(dǎo)，尤其是受藍光的強烈誘導(dǎo)，因此我們推測鹽脅迫下通過EGY1促進花青素合成需要光信號來激活。 (7)本