磷脂酶Dα1和磷脂酸在擬南芥響應(yīng)鹽和干旱脅迫中的作用及其機(jī)理.pdf

1、鹽害引起植物細(xì)胞內(nèi)離子毒害、滲透脅迫,破壞胞內(nèi)離子平衡,進(jìn)而引起一系列次級(jí)脅迫,并最終導(dǎo)致植株代謝失調(diào),甚至死亡。磷脂酶D(phospholipase D,PLD)廣泛存在于細(xì)菌和高等動(dòng)、植物中,它能夠水解磷脂,產(chǎn)生磷脂酸(phosphatidic acid,PA)和極性頭部。研究表明PLD與PA在植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)環(huán)境刺激和激素信號(hào)等過(guò)程中起重要作用。NaCl可誘導(dǎo)綠藻、番茄、苜蓿和擬南芥等高等植物PLD基因表達(dá)和活性升高；而PLDα

2、l是已檢測(cè)的植物中普遍存在、豐度最高的PLD同工酶,但對(duì)于它調(diào)控植物適應(yīng)鹽脅迫機(jī)理方面的研究還很少。本研究以Columbia生態(tài)型擬南芥(野生型)、T-DNA插入敲除PLDαl突變體(pldαl)、RNA干擾MPK6突變體MPK6-RNAi為材料,主要研究了PLDαl、PA及MPK6在鹽脅迫中的作用及相互關(guān)系。研究結(jié)果如下:
　　 首先通過(guò)測(cè)定NaCl脅迫下野生型及pldαl突變體的種子萌發(fā)率、存活率、干物質(zhì)積累量、根部生長(zhǎng)量、

3、葉片細(xì)胞膜透性等生長(zhǎng)和生理指標(biāo),系統(tǒng)比較了野生型和pldαl突變體的耐鹽能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在鹽脅迫下野生型種子萌發(fā)率、幼苗生長(zhǎng)量均顯著高于pldαl突變體；而葉片細(xì)胞電導(dǎo)率則顯著低于pldαl突變體。這些結(jié)果綜合表明PLDαl缺失導(dǎo)致擬南芥耐鹽能力降低,提示PLDαl在擬南芥對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)過(guò)程中起正調(diào)節(jié)作用。
　　 為進(jìn)一步探討PLDαl在植物適應(yīng)鹽脅迫中的作用,我們檢測(cè)了鹽脅迫下野生型及pldαl突變體體內(nèi)PLDα活性的變化

4、,發(fā)現(xiàn),在100 mmol·L-1 NaCl處理30分鐘后野生型幼苗葉片內(nèi)PLDα活性顯著升高,處理1小時(shí)后達(dá)到峰值,隨后隨處理時(shí)間延長(zhǎng)下降到對(duì)照水平；而pldαl葉片中的PLDα基本無(wú)活性,與對(duì)照相比無(wú)顯著變化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)100 mmol·L-1 NaCl處理30分鐘后野生型體內(nèi)PA含量升高,并達(dá)到pldαl突變體的2倍,之后隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而下降,并與pldαl突變體無(wú)顯著差異。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下野生型中水平顯著升高的PA分別為含

5、有34:2,34:3,34:6,36:3,36:6脂肪酸鏈的PA。加入PLD轉(zhuǎn)磷酰基競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑正丁醇抑制PLD水解磷脂產(chǎn)生PA,加重了100 mmol·L-1 NaCl對(duì)野生型和pldαl突變體根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的抑制；而外源PA則減緩了100 mmol·L-1 NaCl對(duì)兩種材料根部生長(zhǎng)的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合表明PA能夠在一定程度上緩解鹽脅迫的傷害。因此我們認(rèn)為,PLDαl通過(guò)PA介導(dǎo)擬南芥對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)過(guò)程。隨后還發(fā)現(xiàn),在鹽處理下,野生

6、型葉片中質(zhì)膜質(zhì)子泵活性先升后降；但pldαl突變體葉片中質(zhì)膜質(zhì)子泵活性變化不大,并且在處理時(shí)間內(nèi),野生型葉片中質(zhì)膜質(zhì)子泵活性一直顯著高于pldαl突變體。用PA體外處理從野生型葉片中提取的質(zhì)膜膜微囊,發(fā)現(xiàn)100μmol·L-1 PA能夠顯著提高質(zhì)膜質(zhì)子泵活性。進(jìn)一步觀(guān)察到,鹽脅迫下野生型幼苗根部Na+含量與pldαl突變體處于同一水平,無(wú)顯著性差異,但其葉片中Na+含量則顯著低于pldαl突變體。并且100 mmol·L-1 NaCl處

7、理下兩種材料葉片和根部K+含量均顯著降低,材料間無(wú)顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明缺失PLDαl影響了擬南芥對(duì)Na+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 MAPK(mitogen-activated protein kinase)的活化被認(rèn)為可以增強(qiáng)植物對(duì)多種脅迫的耐受能力,目前在植物中已發(fā)現(xiàn)鹽脅迫活化多種MAPK,因此人們認(rèn)為MAPK的活化是植物適應(yīng)鹽害的一種基本的信號(hào)反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn),鹽脅迫誘導(dǎo)野生型和pldαl突變體幼苗中以MBP為底物的激酶總活性升

8、高,暗示以MBP為底物的激酶參與了擬南芥對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)過(guò)程；并且野生型顯著高于pldαl突變體,推測(cè)鹽脅迫對(duì)以MBP為底物的激酶的激活在一定程度上依賴(lài)PLDαl。從擬南芥中克隆MPK6的cDNA,并且將MPK6 cDNA截?cái)嗟玫紺-1(889～1188bp)、C-2(589～1188bp)、C-3(229～1188bp)cDNA片段,隨后將它們分別連接至帶有His標(biāo)簽的表達(dá)載體pET-28a(+)當(dāng)中,在大腸桿菌中誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),得到

9、相應(yīng)的MPK6全長(zhǎng)蛋白和C-1(296～396aa)、C-2(196～396aa)、C-3(76～396aa)蛋白片段。利用脂印跡方法檢測(cè)到PA能夠特異性結(jié)合MPK6,并且能與MPK6被截?cái)嗪髿堄嗟腃末端結(jié)合,推測(cè)MPK6的C末端中存在著導(dǎo)致其與PA結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)。Hogl(high osmolarity glycerol)能磷酸化Nhal(Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體)和TOK1(K+離子通道到)等與鹽脅迫相關(guān)的蛋白,促使酵母適應(yīng)鹽脅迫,通

10、過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)MPK6與Hogl39％同源、66％相似,并且酵母功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MPK6的表達(dá)在一定程度上提高了hogl突變菌株的耐鹽性,部分補(bǔ)償了突變體中缺失hogl的影響。進(jìn)一步分析比較MPK6-RNAi突變體與野生型擬南芥的耐鹽能力,發(fā)現(xiàn)前者耐鹽能力弱于后者,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MPK6是介導(dǎo)擬南芥適應(yīng)鹽脅迫過(guò)程的。外施PA能夠提高鹽脅迫下pldαl幼苗干物質(zhì)積累量和根部生長(zhǎng)量,減緩鹽脅迫對(duì)pldαl突變體的傷害,但對(duì)MPK6-RNA

11、i突變體影響不大,說(shuō)明擬南芥中MPK6蛋白表達(dá)被阻斷的影響,不能通過(guò)外源PA而消除。
　　 通過(guò)分析比較野生型與pldαl突變體的耐旱性,發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下,與野生型相比,pldαl突變體葉片發(fā)黃、嚴(yán)重萎蔫,植株生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制,葉片相對(duì)電導(dǎo)率顯著增高,葉片相對(duì)含水量則顯著降低；在干旱脅迫早期,氣孔開(kāi)度則顯著高于野生型。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)PLDαl及PA通過(guò)調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng),控制水分散失,介導(dǎo)擬南芥對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。
　　 另外我們

12、觀(guān)察了ABA對(duì)野生型、pldαl突變體種子萌發(fā)的影響,發(fā)現(xiàn)ABA處理下二者種子萌發(fā)率相差不大,但野生型胚軸明顯比pldαl突變體短、細(xì),推測(cè)PLDαl及PA轉(zhuǎn)導(dǎo)ABA信號(hào),介導(dǎo)了ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制過(guò)程。隨后分別以150 mmol·L-1甘露醇、75 mmol·L-1 NaCl進(jìn)行干旱和鹽處理,發(fā)現(xiàn)野生型與pldαl突變體內(nèi)源ABA水平無(wú)顯著差異,推測(cè)缺失PLDαl并不影響干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)ABA含量升高。
　　 上述研究表明,

13、PLDαl及PA介導(dǎo)了擬南芥對(duì)鹽和干旱脅迫的響應(yīng)過(guò)程。在鹽脅迫下PLDαl活性及PA水平升高,一方面激活質(zhì)膜質(zhì)子泵,為質(zhì)膜Na+經(jīng)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)排出胞外提供驅(qū)動(dòng)力；另一方面結(jié)合MPK6,通過(guò)它轉(zhuǎn)導(dǎo)鹽信號(hào)。此外,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室其他研究者前期研究結(jié)果,在滲透脅迫下PLDαl和PA調(diào)控氣孔開(kāi)度,減少水分蒸騰。推測(cè)PLDαl和PA可能通過(guò)調(diào)控氣孔開(kāi)度,減少水分蒸騰,減少隨蒸騰作用向葉片運(yùn)輸?shù)腘a+,提高植物耐鹽能力。PLDαl及PA轉(zhuǎn)導(dǎo)AB