Notch信號(hào)報(bào)告系統(tǒng)在前列腺腫瘤細(xì)胞系中的建立及TRIM59在乳腺癌中生物學(xué)功能的研究.pdf

1、本研究采用In-Fusion酶系統(tǒng)將帶有CMV啟動(dòng)子的8拷貝串聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子CSL的結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列克隆入pLVX-acGFP-N1慢病毒載體，構(gòu)建Notch信號(hào)報(bào)告重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒（pLVX-8XCSL-acGFP）。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pLVX-8XCSL-acGFP質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒pLVX-acGFP，6小時(shí)后，再轉(zhuǎn)染Notch受體的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）的表達(dá)質(zhì)粒pETP-NICD或?qū)φ召|(zhì)粒pETP。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后熒光顯微鏡

2、觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，并且用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光定量分析。然后，將pLVX-8XCSL-acGFP質(zhì)粒及對(duì)照質(zhì)粒包裝成慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞系 LNCaP，72小時(shí)后熒光顯微鏡觀察綠色熒光，用流式細(xì)胞儀分選出GFP熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的5％及最弱的5%的細(xì)胞。提取這兩部分細(xì)胞的RNA，并采用 qRT-PCR方法檢測(cè)比較這兩群細(xì)胞中的Notch1,Notch2以及 Notch信號(hào)通路下游靶基因 Hey1的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染pLVX-8XCSL-acG

3、FP的HEK-293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NICD可顯著增加細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，定量分析顯示和對(duì)照組相比熒光強(qiáng)度增加了約10倍。而轉(zhuǎn)染pLVX-acGFP的293T細(xì)胞過(guò)表達(dá) NICD，熒光強(qiáng)度則無(wú)明顯改變。根據(jù) pLVX-8XCSL-acGFP熒光強(qiáng)度分選出的LNCaP細(xì)胞，熒光強(qiáng)度高的細(xì)胞中的Notch1,Notch2和Hey1表達(dá)水平也比較高。本研究實(shí)驗(yàn)證明在LNCaP細(xì)胞中pLVX-8XCSL-acGFP可以作為報(bào)告notch信號(hào)水平的有效

4、工具，為進(jìn)一步研究 Notch信號(hào)通路對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞的影響打下基礎(chǔ)。
　　本文研究了TRIM家族成員TRIM59蛋白在乳腺癌中的生物學(xué)功能，為乳腺癌的治療提供新的靶標(biāo)。我們首先通過(guò)對(duì)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)檢索分析發(fā)現(xiàn)，TRIM59在乳腺癌中顯著高表達(dá)。為了研究TRIM59在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中生物學(xué)功能，我們?cè)谌橄侔┘?xì)胞系 MDA-MB-231中分別構(gòu)建了TRIM59-knockdown和TRIM59-overexpression

5、的穩(wěn)定細(xì)胞系，分別通過(guò)體外的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)探究 TRIM59的具體作用。結(jié)果顯示TRIM59敲低后，細(xì)胞的增殖減慢，克隆形成能力減弱，細(xì)胞的遷移能力下降；反之，TRIM59過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力以及細(xì)胞的遷移能力均增強(qiáng)。體內(nèi)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，TRIM59敲低后裸鼠成瘤能力下降；TRIM59過(guò)表達(dá)后，裸鼠成瘤能力增強(qiáng)。綜上所述，體內(nèi)和體外結(jié)果均