靶向肝癌細(xì)胞的納米硒化anisomycin的抗瘤活性及其機(jī)制.pdf

1、肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的一種肝臟腫瘤。肝癌具有病情發(fā)展快、惡性度高、生存期短等特點(diǎn)。臨床上治療癌癥的主要方法有手術(shù)切除、放射性治療和藥物化療,手術(shù)切除仍然是治療肝癌的首選。然而,即使手術(shù)切除后，患者在五年內(nèi)的肝癌復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率都很高，這給臨床上肝癌治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。而且，肝癌患者在確診時(shí)通常已發(fā)展到中晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。目前，藥物化療是治療癌癥普遍使用的一種策略。常用

2、的化療藥物缺乏選擇性，具有很大的毒副作用。因此，傳統(tǒng)的化療對(duì)肝癌的治療效果非常有限。
　　納米材料的興起為抗癌藥物的發(fā)展帶來新的契機(jī)。開發(fā)安全、穩(wěn)定、靶向以及藥物可控釋放的多功能藥物載體對(duì)人類腫瘤的診斷和治療都具有重要意義。納米材料具有表面積大、生物兼容性好以及易于修飾等優(yōu)良特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)抗癌藥物的高效、靶向投遞。因此，發(fā)展納米材料載體用于靶向運(yùn)輸藥物給抗癌藥物的發(fā)展帶來新的曙光。
　　癌細(xì)胞由于分裂生長迅猛、活動(dòng)旺盛，因此形

3、成了不同于正常組織、細(xì)胞的病理和代謝變化：新生腫瘤血管結(jié)構(gòu)不完整，腫瘤血管的滲透滯留效應(yīng)增強(qiáng)（enhanced permeability and retention，EPR），無氧代謝、生長失控和跨膜pH調(diào)節(jié)能力提升形成的腫瘤細(xì)胞外部弱酸環(huán)境和腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)受體的表達(dá)上調(diào)。這些不同于正常組織的病理特征，正好為靶向納米遞藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和應(yīng)用提供了依據(jù)。針對(duì)肝臟腫瘤細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)某些受體分子高表達(dá)特性，本文設(shè)計(jì)合成了3種功能化納米硒SeN

4、Ps@Am、HA-SeNPs@Am和HT-SeNPs@Am載藥系統(tǒng)，探索它們對(duì)肝癌細(xì)胞的選擇性、抗腫瘤活性及其機(jī)制，旨在尋找潛在的抗肝癌靶向藥物。全文共分為四個(gè)章節(jié)。
　　第一章：緒論
　　簡要介紹目前肝癌發(fā)展的現(xiàn)狀，傳統(tǒng)化療藥物的不足和局限以及納米藥物載體用于腫瘤治療的優(yōu)勢(shì)。重點(diǎn)介紹了納米硒作為抗腫瘤藥物載體的優(yōu)勢(shì)以及anisomycin在抗腫瘤方面的研究進(jìn)展。最后介紹本課題的選題依據(jù)、意義及其創(chuàng)新點(diǎn)。
　　第二章：

5、被動(dòng)靶向肝癌細(xì)胞的功能化納米硒SeNPs@Am的制備、抗腫瘤活性及其機(jī)制
　　被動(dòng)靶向的原理是基于EPR效應(yīng)將藥物負(fù)載在納米尺寸的載體上，經(jīng)血液循環(huán)靶向進(jìn)入腫瘤組織，從而實(shí)現(xiàn)組織水平的腫瘤靶向。同時(shí)結(jié)合腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境，實(shí)現(xiàn)藥物的有效釋放?；谶@點(diǎn)，將細(xì)菌源性小分子抗生素anisomycin（Am）負(fù)載于納米硒 SeNPs上，制備功能化納米硒 SeNPs@Am，實(shí)現(xiàn)藥物anisomycin的被動(dòng)靶向輸送至人肝癌細(xì)胞的目的。

6、>　　SeNPs@Am的合成路徑如下：通過維生素C（vitamin C，Vc）還原亞硒酸鈉（Na2SeO3），嘗試多種條件下制備不同粒徑的納米硒（selenium nanparticles， SeNPs）載體，選擇最佳粒徑SeNPs作為納米硒載體，在其表面負(fù)載anisomycin，制備納米硒化SeNPs@Am。與未修飾的SeNPs相比，anisomycin修飾使得納米硒粒徑更小，分散更均勻。此外，在納米硒表面連接香豆素-6，使得該納米藥

7、物載體帶有綠色熒光，利于研究SeNPs@Am的細(xì)胞攝取行為。
　　探索不同粒徑下的SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞內(nèi)的吸收，發(fā)現(xiàn)粒徑為56 nm的SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞內(nèi)的吸收量最大。因此，選取該粒徑的SeNPs@Am用于后續(xù)生物功能實(shí)驗(yàn)的研究；通過透射電鏡、元素分析和納米粒度儀等分析SeNPs@Am的形貌、元素組成及粒徑大?。焕眉t外光譜和核磁共振儀表征SeNPs@Am分子結(jié)構(gòu)信息；藉熒光顯微鏡和電感耦合等離子體質(zhì)譜（

8、Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）弄清SeNPs@Am在細(xì)胞中的定性和定量吸收及其胞內(nèi)的定位；運(yùn)用藥物釋放試驗(yàn)觀察 SeNPs@Am在不同pH條件下anisomycin的釋放；借助不同內(nèi)吞抑制劑確定SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞中的內(nèi)吞方式；采用MTT法檢測(cè)SeNPs@Am處理后HepG2細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)分析 SeNPs@Am處理后HepG2細(xì)胞的周期和凋亡變

9、化；TUNEL-DAPI雙染色進(jìn)一步確證 SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞凋亡中的作用；細(xì)胞劃痕和 Transwell試驗(yàn)觀察SeNPs@Am對(duì)HepG2細(xì)胞遷移的影響；Western Blot分析SeNPs@Am處理后 HepG2細(xì)胞的周期調(diào)控蛋白和凋亡相關(guān)蛋白變化與細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系;比較SeNPs@Am與anisomycin的作用差異。
　　結(jié)果表明，成功合成了功能化納米硒 SeNPs@Am；SeNPs@Am在 HepG2

10、細(xì)胞攝取量高于未修飾的SeNPs；SeNPs@Am通過巨胞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，阻滯細(xì)胞在 G0/G1期，促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞遷移，這主要通過激活P53/P73/P21/P27和caspase-9/caspase-8/caspase-3信號(hào)，并下調(diào) CDK-2和ICBP90的活性而實(shí)現(xiàn)，似乎與P16、Rb和E2F1無關(guān)；在等量anisomycin下， SeNPs@Am較anisomycin顯現(xiàn)更強(qiáng)的抑制HepG2細(xì)胞生長

11、和遷移并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的活性。結(jié)果提示，將 anisomycin負(fù)載于SeNPs形成功能化納米硒SeNPs@Am后，具有一定的被動(dòng)靶向抗肝癌活性，其作用優(yōu)于未修飾的anisomycin。
　　第三章：主動(dòng)靶向肝癌細(xì)胞的功能化納米硒HA-SeNPs@Am的制備、抗腫瘤活性及其機(jī)制
　　通過 EPR效應(yīng)只能實(shí)現(xiàn)有限的組織水平上的腫瘤靶向，除了腫瘤細(xì)胞外的微酸環(huán)境，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的受體可用作靶點(diǎn)，通過在納米載體上修飾可

12、以與這些受體產(chǎn)生特異性結(jié)合的靶向分子，從而實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞的策略。這需要選擇合適的受體和與之相結(jié)合的靶向分子。文獻(xiàn)表明，透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）的受體CD44分子在肝腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，因此，HA可作為腫瘤靶向分子用于設(shè)計(jì)靶向肝癌的納米載藥系統(tǒng)。
　　HA-SeNPs@Am的合成路徑如下：將Na2SeO3溶液滴加至Vc與anisomycin混合溶液后，形成功能化納米硒SeNPs@Am，在其表面連接HA，

13、制備主動(dòng)靶向肝癌細(xì)胞的納米硒化HA-SeNPs@Am。在納米硒表面連接香豆素-6和Cy5.5，使得該納米藥物載體分別帶有綠色和紅色熒光，利于研究 HA-SeNPs@Am的細(xì)胞攝取和體內(nèi)分布。
　　同上方法分析 HA-SeNPs@Am的形貌、元素組成及粒徑大小，表征HA-SeNPs@Am分子結(jié)構(gòu)信息，弄清 HA-SeNPs@Am在 RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2細(xì)胞中的定性和定量吸收及其胞內(nèi)定位，觀察HA-Se

14、NPs@Am在不同pH條件下anisomycin的釋放，確定HA-SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞中的內(nèi)吞方式，檢測(cè)HA-SeNPs@Am對(duì)RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2細(xì)胞增殖的抑制效果，分析HA-SeNPs@Am處理RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2細(xì)胞后細(xì)胞周期和凋亡的變化，測(cè)定HA-SeNPs@Am處理后RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2細(xì)胞遷移的變化，探明HA-SeNP

15、s@Am處理后HepG2細(xì)胞的周期調(diào)控蛋白和凋亡相關(guān)蛋白變化與細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系；比較HA-SeNPs@Am與SeNPs@Am對(duì)HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的作用差異。
　　有文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)錄因子 Oct4、Sox2和 Nanog在肝癌干細(xì)胞中高表達(dá)，且Oct4在肝癌干細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色。那么，HA-SeNPs@Am是否通過Oct4影響HepG2細(xì)胞凋亡及其與Sox2和Nanog之間的關(guān)系？因此，利用單獨(dú)或聯(lián)合敲低oct4、so

16、x2和nanog基因策略，通過流式細(xì)胞術(shù)、qPCR和Western Blot分析HA-SeNPs@Am誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡與Oct4、Sox2、Nanog的mRNA和蛋白表達(dá)的關(guān)系，以及與GSK-3β和β-catenin表達(dá)的關(guān)聯(lián)；進(jìn)一步通過荷瘤裸鼠模型評(píng)價(jià)HA-SeNPs@Am在RT-112和HepG2不同腫瘤組織中的靶向分布和體內(nèi)治療效果。
　　結(jié)果表明，成功合成了肝癌靶向的功能化納米硒 HA-SeNPs@Am，它在RT-

17、112、HepG2、HUVEC-12和 Lo-2細(xì)胞間的生物活性具有選擇性；與SeNPs@Am比較，HA-SeNPs@Am靶向HepG2細(xì)胞活性更高，抑制細(xì)胞生長的作用更強(qiáng)；體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)HA-SeNPs@Am能靶向聚集于HepG2肝癌組織內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。結(jié)果提示，HA-SeNPs@Am具有主動(dòng)靶向抗肝癌活性，其作用優(yōu)于SeNPs@Am；HA-SeNPs@Am除了通過激活P53/P73/P21/P27和JNK/Bim/caspase-9

18、/caspase-8/caspase-3信號(hào)，抑制ICBP90和Bcl-xL的活性而發(fā)揮作用外，還通過激活肝癌細(xì)胞中GSK-3β，抑制β-catenin，下調(diào)Oct4、Sox2和Nanog的水平，抑制肝癌干細(xì)胞增殖，從而抑制肝臟腫瘤的生長；此作用可能也與HA-SeNPs@Am阻止CD4+T細(xì)胞向Treg、Th17和Th22細(xì)胞分化，上調(diào)TNF-α和IFN-γ，抑制TGF-β和IL-10分泌有關(guān)。
　　第四章：主動(dòng)靶向肝癌細(xì)胞的功能

19、化納米硒 HT-SeNPs@Am的制備、抗腫瘤活性及其機(jī)制
　　有文獻(xiàn)報(bào)道，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）受體在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)?；谶@點(diǎn)，我們將肝癌靶向分子5-HT連接在負(fù)載抗腫瘤藥物anisomycin的功能化納米硒表面，制備一種新型的靶向肝癌的納米硒化HT-SeNPs@Am。通過5-HT與肝癌細(xì)胞高表達(dá)的5-HT受體分子的特異性結(jié)合來實(shí)現(xiàn)anisomycin向肝癌細(xì)胞靶向投遞的目的。
　

20、　HT-SeNPs@Am的合成路徑如下：將Na2SeO3溶液滴加至Vc與anisomycin混合溶液后，形成功能化納米硒SeNPs@Am，在其表面連接5-HT，制備靶向肝癌細(xì)胞的納米硒化HT-SeNPs@Am。在納米硒表面連接香豆素-6和Cy5.5，使得該納米藥物載體分別帶有綠色和紅色熒光，利于研究 HT-SeNPs@Am的細(xì)胞攝取和體內(nèi)分布。
　　同上方法分析 HT-SeNPs@Am的形貌、元素組成及粒徑大小，表征HT-SeNP

21、s@Am分子結(jié)構(gòu)信息，弄清HT-SeNPs@Am在HepG2、Lo-2、HUVEC-12和 A549細(xì)胞中的吸收及其胞內(nèi)定位，觀察 HT-SeNPs@Am在不同條件下anisomycin的釋放，確定 HT-SeNPs@Am在 HepG2細(xì)胞中的內(nèi)吞方式，檢測(cè)HT-SeNPs@Am對(duì)HepG2、Lo-2、HUVEC-12和A549細(xì)胞增殖的抑制效果，分析 HT-SeNPs@Am處理后 HepG2的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化，測(cè)定HT-SeN

22、Ps@Am處理后HepG2、Lo-2、HUVEC-12和A549細(xì)胞遷移的變化，探明HT-SeNPs@Am處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)Stat1、Stat3、c-jun、Bim、E2F2和HIF-1α蛋白表達(dá)變化與細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系。單獨(dú)或聯(lián)合敲低 stat3、hif-1α和 e2f2基因，進(jìn)一步確定Stat3、HIF-1α和E2F2之間的關(guān)系。評(píng)價(jià)HT-SeNPs@Am在RT-112和 HepG2不同腫瘤組織中的靶向分布和體內(nèi)治療效果，比

23、較HT-SeNPs@Am與HA-SeNPs@Am的作用差異。
　　結(jié)果表明，成功合成了肝癌靶向的功能化納米硒 HT-SeNPs@Am，其在HepG2、Lo-2、HUVEC-12和A549細(xì)胞中的生物活性具有選擇性；與anisomycin比較，HT-SeNPs@Am能靶向 HepG2細(xì)胞，抑制細(xì)胞生長的作用更強(qiáng)；與HA-SeNPs@Am比較，HT-SeNPs@Am對(duì)HepG2細(xì)胞的選擇性及其生物學(xué)行為的影響相似，體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)HT-S

24、eNPs@Am能靶向聚集于HepG2肝癌組織內(nèi)發(fā)揮更明顯的抗腫瘤作用。結(jié)果提示，HT-SeNPs@Am具有主動(dòng)靶向抗肝癌活性，其作用稍優(yōu)于HA-SeNPs@Am；HT-SeNPs@Am可能通過激活c-jun/Bim/Stat1信號(hào)，下調(diào) Stat3、HIF-1α和 E2F2的水平，阻止肝癌細(xì)胞增殖，從而抑制腫瘤的生長。此作用可能也與HA-SeNPs@Am阻止CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Th22細(xì)胞分化，上調(diào)TNF-α和I