小鼠細(xì)胞中外源piRNA對(duì)DHRS4基因和piRNA表達(dá)的調(diào)控.pdf

1、目的：全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）是生物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄參與細(xì)胞正常生長(zhǎng)、增值、分化、凋亡，以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增值等。有研究發(fā)現(xiàn)維甲酸水平高低可調(diào)控精子和卵子發(fā)生中的減數(shù)分裂過(guò)程。生殖細(xì)胞內(nèi)必須保證一定維甲酸水平才能起始減數(shù)分裂。所以體內(nèi)生理作用劑量的atRA受到嚴(yán)格的控制，其濃度的維持是由多種酶、多種蛋白因子參與的精細(xì)調(diào)節(jié)過(guò)程。atRA

2、的合成為維生素A（亦稱(chēng)為視黃醇retinol）先氧化為視黃醛（retinal）再進(jìn)一步氧化為RA。從Retinol到Retinal這一步為可逆反應(yīng)，亦為atRA合成的限速步驟。輔酶Ⅱ依賴(lài)性視黃醇脫氫/還原酶（ NADP(H)-dependent retinol dehydrogense/reductase,NRDR）在從視黃醇到視黃醛這一步中起著關(guān)鍵作用。編碼 NRDR的基因在人體具有三個(gè)拷貝，分別命名為DHRS4、DHRS4L2和DH

3、RS4L1，在黑猩猩、類(lèi)人猿只存在兩個(gè)拷貝，而在其他很多哺乳動(dòng)物體內(nèi)只存在DHRS4單拷貝，比如鼠、豬、牛等。
　　piRNA(Piwi-interacting RNA)是從哺乳動(dòng)物睪丸組織中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)能與PIWI蛋白相結(jié)合的小RNA，主要表達(dá)于不同物種的生殖細(xì)胞中，是繼小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）之后新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)非編碼小分子RNA。piRNA長(zhǎng)度在26～31 nt左右，大部分集中在29～

4、30 nt，在5’具有明顯的尿嘧啶偏愛(ài)性(約86％)，且80%以上在基因組中有單一位點(diǎn)。piRNA的表達(dá)有明顯時(shí)序性，精子發(fā)育過(guò)程中進(jìn)入減數(shù)分裂粗線期會(huì)產(chǎn)生PIWI蛋白，伴隨PIWI蛋白的生物發(fā)生會(huì)出現(xiàn)大量的piRNA，使得減數(shù)分裂順利進(jìn)行。因此，piRNA被認(rèn)為是生殖細(xì)胞減數(shù)分裂的重要事件之一。
　　生殖細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂的另一個(gè)必要條件是細(xì)胞內(nèi)要保持一定維甲酸（Retinoic Acid，RA）水平。那么體內(nèi)對(duì)維甲酸起調(diào)控作用的

5、NRDR水平是否會(huì)受到piRNA大量出現(xiàn)的調(diào)控呢？為探討二者間的內(nèi)在聯(lián)系，我們針對(duì)小鼠DHRS4基因的piRNA設(shè)計(jì)單鏈轉(zhuǎn)染序列，研究其piRNA的改變是否會(huì)調(diào)控DHRS4基因的表達(dá)，以致影響NRDR。此外也探討了外源性piRNA對(duì)內(nèi)源性piRNA是否有調(diào)控作用。
　　方法：利用生物信息學(xué)方法查找 DHRS4基因上的piRNA位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成短單鏈piRNA，將其轉(zhuǎn)染小鼠睪丸畸胎瘤（P19）和小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞（TM4），24小時(shí)候后

6、收獲細(xì)胞，通過(guò)RNA提取，RT-PCR，real-time PCR，蛋白免疫印跡方法檢測(cè)小鼠DHRS4基因表達(dá)情況。此外通過(guò)轉(zhuǎn)染外源性piRNA，檢測(cè)內(nèi)源性piRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)位于DHRS4基因中第二內(nèi)含子區(qū)域的2個(gè)piRNA中有一個(gè)促進(jìn)DHRS4基因的表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn)外源piRNA對(duì)內(nèi)源piRNA的表達(dá)也有促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：piRNA對(duì)靶基因表達(dá)可能還有正向調(diào)控作用，豐富了piRNA的生物學(xué)功能