巨噬細胞活化對NEC腸道ICCs表型改變的影響及其機理研究.pdf

1、第一部分NEC患兒腸道巨噬細胞的活化、TNF-α的表達及ICCs的表型改變
　　目的：研究NEC患兒腸道巨噬細胞的活化、TNF-α的表達及ICCs的表型改變情況，探究其在NEC發(fā)病中的作用。
　　方法：采用HE染色、免疫熒光雙染、免疫組化、Westen blot及RT-PCR等技術(shù)對正常小腸組織和NEC小腸組織進行對比研究。
　　結(jié)果：HE染色—正常小腸絨毛排列整齊，腸壁無水腫及充血，而NEC患兒小腸絨毛壞死，腸壁充血

2、，腸壁有大量炎性細胞浸潤。免疫熒光雙染—正常小腸有少量 CD68陽性的巨噬細胞表達，未見巨噬細胞活化，而NEC腸道有大量M1型巨噬細胞浸潤，未見M2型巨噬細胞表達。免疫組化和western blot—NEC組腸道TNF-α蛋白表達明顯高于正常組，且TNF-α陽性表達區(qū)域主要分布于粘膜層以及環(huán)行肌和縱行肌之間。c-kit的免疫組化染色可見正常小腸ICCs主要分布于環(huán)行肌和縱行肌之間、環(huán)行肌內(nèi)和縱行肌內(nèi)，NEC組小腸未見 c-kit陽性表達

3、。RT-PCR結(jié)果與蛋白表達結(jié)果一致，可見NEC組小腸CD68、iNOS及TNF-αmRNA的表達明顯高于正常組，而c-kit mRNA的表達明顯低于正常組。
　　結(jié)論：NEC腸道有大量M1型巨噬細胞浸潤，TNF-α表達顯著升高。在NEC發(fā)病過程中，腸道ICCs發(fā)生表型改變，這可能與腸道運動功能紊亂有關(guān)。
　　第二部分巨噬細胞對NEC小鼠腸道ICCs表型改變的影響
　　目的：進一步在動物模型中研究NEC腸道巨噬細胞活化

4、、TNF-α表達及ICCs的表型改變情況，研究巨噬細胞對NEC腸道TNF-α表達及ICCs表型改變的影響。
　　方法：新生鼠隨機分為4組：正常組，未進行缺氧、注射用藥及冷刺激；NEC組，采用缺氧冷刺激的方式制作NEC動物模型；NEC+NS組，在NEC模型制作前24小時腹腔注射生理鹽水60μl；NEC+CL組，在NEC模型制作前24小時腹腔注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體溶液60μl。分別于實驗第2天（NEC早期）、第4天（NEC進展期）、第8

5、天（NEC恢復期）及第15天（腸道恢復）提取小鼠小腸組織，行HE染色對腸道進行病理評分，觀察各組 NEC發(fā)生率，采用免疫熒光雙染、免疫組化、Westen blot及RT-PCR等技術(shù)檢測各組腸道巨噬細胞的活化、TNF-α的表達及ICCs的表型改變情況。
　　結(jié)果：氯膦酸二鈉脂質(zhì)體在NEC早期和NEC恢復期能明顯減少M1型巨噬細胞的表達，但在NEC進展期這種抑制作用減弱。在NEC早期M1型巨噬細胞低表達能明顯減輕NEC腸道的損傷，降

6、低NEC發(fā)生率和TNF-α的表達，并能減輕腸道ICCs的損傷。在NEC恢復期M1型巨噬細胞低表達能降低TNF-α的表達，促進腸道組織修復及ICCs表型的恢復。
　　結(jié)論:M1型巨噬細胞在NEC腸道的炎性損傷中具有重要作用，抑制M1型巨噬細胞不僅能降低TNF-α的表達，減輕腸道的炎性損傷和ICCs的損傷，還能在恢復期促進腸道組織的修復及ICCs表型的恢復。
　　第三部分TNF-α對腸道ICCs表型改變的影響及其機理研究

7、　　目的：研究TNF-α抑制c-kit的表達，導致ICCs發(fā)生表型改變的機制。
　　方法：出生24小時內(nèi)將B6小鼠隨機分為4組：正常對照組，對腸管進行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)液中未加TNF-α；空白對照組，未培養(yǎng)的腸管；TNF-α組，對腸管進行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入不同濃度的TNF-α；miR-222拮抗組，新生小鼠腹腔注射miR-222拮抗劑24小時后對腸管進行組織培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入不同濃度的TNF-α。小腸組織培養(yǎng)48小時后采用RT-P

8、CR及Western blot技術(shù)檢測腸組織中miRNA-222、c-kit mRNA及c-kit蛋白的表達。雙熒光素酶實驗鑒定c-kit是否為miRNA-222的靶基因。
　　結(jié)果：當培養(yǎng)液中TNF-α濃度在100-500ng/ml時，miRNA-222的表達上調(diào)并抑制c-kit mRNA和蛋白的表達。使用miR-222拮抗劑之后，在培養(yǎng)液TNF-α濃度在100-200ng/ml時，可逆轉(zhuǎn)這種抑制作用，但是當培養(yǎng)液中TNF-α濃