苜草素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞NO、IL-6、TNF-α分泌的影響及其機(jī)理研究.pdf

1、巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成份,具有吞噬、殺傷、遞呈抗原、分泌生物活性物質(zhì)、調(diào)控局部組織微環(huán)境以及抑制腫瘤等多種功能,構(gòu)成了機(jī)體非特異防御的主要基礎(chǔ).本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)苜草素對(duì)肉仔雞的免疫機(jī)能具有增強(qiáng)作用,對(duì)小鼠外周淋巴細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用.為了進(jìn)一步研究揭示苜草素對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的作用效果及其機(jī)理,以BABL/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過(guò)活體上觀察、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞因子及其mRNA表達(dá)量檢測(cè)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多層次和系統(tǒng)的試驗(yàn)分析,研究了苜

2、草素對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響及其機(jī)理. 試驗(yàn)一苜草素對(duì)BABL/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性、代謝活性的影響 為了檢測(cè)苜草素在體內(nèi)對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞功能的影響,本試驗(yàn)以50只雄性,6-8周齡Balb/c小鼠,隨機(jī)分為四組:空白組,300mg/kg·d、500 mg/kg·d、1000 mg/kg·d組,每組10只.每大灌胃給藥一次,空白對(duì)照組用等體積的0.9﹪生理鹽水代替,連續(xù)14d.于第14d處死,制備腹腔巨噬細(xì)胞,測(cè)定苜草素對(duì)

3、其吞噬活性、代謝活性的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著苜草素劑量的增加,巨噬細(xì)胞的吞噬活性逐漸增加,并在1000 mg/kg·d時(shí)達(dá)到顯著性差異(P<0.05).但是對(duì)巨噬細(xì)胞的代謝活性沒(méi)有顯著影響. 試驗(yàn)二苜草素對(duì)巨噬細(xì)胞RAW26.7吞噬活性和NO、IL-6、 TNF-α分泌量的影響 為確定苜草素對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性和 NO、IL-6、TNF-α分泌量的影響,以不同濃度(0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mg/ml)的苜草素處

4、理RAW26.7巨噬細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著苜草素濃度的增加RAW264.7的吞噬活性也逐漸增加趨勢(shì),在0.4mg/ml時(shí)開(kāi)始呈現(xiàn)顯著性籌異 (P<0.05),住1mg/ml時(shí)巨噬細(xì)胞的吞噬能力達(dá)到最高達(dá)到最大值,這與活體觀察結(jié)果相一致.對(duì)丁NO的分泌能力,隨著苜草素濃度的增加,其逐漸降低了LPS誘導(dǎo)的NO的分泌.與LPS處理組相比,在 0.6mg/ml的劑量卜開(kāi)始成顯著性差異(P<0.05).在1mg/ml下達(dá)到最人抑制效果.而且苜草素逐

5、漸抑制了LPS誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生.與LPS處理組相比,從0.2mg/ml時(shí)開(kāi)始就已經(jīng)出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01),并逐漸降低,在1mg/L時(shí)抑制作用達(dá)到最火程度.苜草素增加了RAW26.7對(duì)TNF-α的分泌量,并隨著苜草素劑量的增加,TNF-α的分泌量逐漸升高,與空白組相比,從0.6mg/ml開(kāi)始就已經(jīng)出現(xiàn)顯著性差異 (P<0.01),在1mg/ml時(shí)升高到到最大程度. 試驗(yàn)三苜草素對(duì)巨噬細(xì)胞RAW26.7 iNOS、IL-6

6、、 TNF-α mRNA表達(dá)量的影響 為進(jìn)一步確定苜草素對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NO、TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)量是否產(chǎn)生影響,首先確定了iNOS、TNF-α、IL-6的最佳RT-PCR條件,又以不同濃度的苜草素(0.2,0.4,0.8,1.0mg/ml)和脂多糖(10μg/ml)處理RAW264.7 細(xì)胞,然后檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、及IL-6mRNA的表達(dá)水平變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著苜草素劑量的增加,iNOS和I

7、L-6 mRNA的表達(dá)量逐漸下降,這與前期檢測(cè)NO和 IL-6 的分泌減少相吻合.因此可以推測(cè),苜草素降低NO和IL-6分泌的原因是是抑制了iNOS和IL-6 mRNA的表達(dá).苜草素對(duì)TNF-α mRNA的表達(dá)的影響與其相反,其顯著增加了巨噬細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)量,這與前期檢測(cè)TN-α的分泌結(jié)果相吻合.綜上所述,苜草素通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞iNOS、IL-6、TN-α基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而調(diào)節(jié)了NO、IL-6、TNF-α的分泌量.試驗(yàn)四苜

8、草素通過(guò)p38MAPK調(diào)控TNF-α的表達(dá)和分泌為了研究p38MAPK是否在苜草素對(duì)TNF-α mRNA的調(diào)控中起到作用,首先確定了苜草素刺激巨噬細(xì)胞的最佳濃度和最佳時(shí)間,然后以0.01、0.1、1、5、10、20μ g/ml的p38MAPK抑制劑SB203580預(yù)處理巨噬細(xì)胞以抑制p38MAPK,最后在最適的苜草素濃度和最適時(shí)間下再處理巨噬細(xì)胞,然后檢測(cè)SB203580對(duì)苜草素處理的巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)和分泌的影響.我們發(fā)現(xiàn)S820