碳酸鹽堿度脅迫下尼羅羅非魚HCO3-離子代謝和轉(zhuǎn)運的途徑.pdf

1、在碳酸鹽型水環(huán)境中，魚類除了維持滲透壓調(diào)節(jié)外，還面臨著酸堿平衡調(diào)節(jié)的壓力。通常認(rèn)為，碳酸鹽型堿水對魚類生存影響主要通過干擾其血液緩沖系統(tǒng)。其中，HCO3-是血液緩沖系統(tǒng)中最重要的組成成分。尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）是重要的淡水養(yǎng)殖魚類，同時，對碳酸鹽堿度有一定的耐受能力。本論文以尼羅羅非魚為材料，開展了不同濃度（0、2和4 g/L NaHCO3）碳酸鹽堿度急性脅迫實驗，分析了尼羅羅非魚的生理水平（血清滲透壓

2、、Na+、K+、Cl-、HCO3-濃度、pH）、生化水平（CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6酶活力）、細(xì)胞水平（鰓離子細(xì)胞亞型、數(shù)目、開孔大?。⒎肿铀剑–AⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6基因和蛋白相對表達(dá)量）變化情況，旨在研究碳酸鹽堿度脅迫下，羅非魚如何實現(xiàn)體內(nèi)HCO3-的調(diào)節(jié)。主要結(jié)果如下：
　?。?）采用掃描電鏡和免疫組化技術(shù)，觀察了不同碳酸鹽堿度（0、2、4 g/L NaHCO3）脅迫對尼羅羅非魚鰓離

3、子細(xì)胞形態(tài)變化的影響以及鰓、腎、腸中碳酸酐酶Ⅱ（CAⅡ）、碳酸酐酶Ⅳ（CAⅣ）、Na+/HCO3-協(xié)同轉(zhuǎn)運載體（SLC4A4）、Cl-/HCO3-離子交換體（SLC26A6）的免疫組化反應(yīng)變化。掃描電鏡結(jié)果表明，鰓離子細(xì)胞分布在鰓小片基部。根據(jù)其表面開孔形狀和尺寸，可分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型4種亞型，各亞型離子細(xì)胞的開孔尺寸隨碳酸鹽堿度升高呈正比增大，Ⅲ型離子細(xì)胞開孔尺寸變化最明顯（P＜0.01）；離子細(xì)胞總數(shù)目也隨碳酸鹽堿度升高而增

4、加，Ⅲ型細(xì)胞數(shù)目上升最為顯著（P＜0.01）。免疫組化結(jié)果表明，在淡水、碳酸鹽堿水組中， CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6在鰓小片基部和腎臟中均有陽性反應(yīng)，且隨著碳酸鹽堿度升高，陽性反應(yīng)增強，但在腸道中未觀察到陽性反應(yīng)。結(jié)果初步表明，尼羅羅非魚可通過調(diào)節(jié)鰓離子細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量適應(yīng)碳酸鹽堿度變化，鰓和腎為主要應(yīng)答調(diào)節(jié)器官。
　?。?）為了探討魚類在碳酸鹽堿水環(huán)境中的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制，將尼羅羅非魚從淡水直接轉(zhuǎn)入2 g/L和4 g

5、/L NaHCO3堿水中進(jìn)行急性脅迫試驗，分別檢測脅迫后0、3、6、12、24、48、72、96和192 h時血清滲透壓、血清 Na+、K+、Cl-和 HCO3-濃度以及鰓、腎和腸中酶碳酸酐酶（CAⅡ、CAⅣ）、Na+/HCO3-協(xié)同轉(zhuǎn)運載體（SLC4A4）、Cl-/HCO3-離子交換體（SLC26A6）酶活力變化。結(jié)果顯示：不同碳酸鹽堿度脅迫下，尼羅羅非魚血清滲透壓、離子濃度以及鰓、腎、腸中相關(guān)調(diào)節(jié)因子酶活力均隨碳酸鹽堿度升高而升高。

6、隨時間推移，血清滲透壓、離子濃度呈現(xiàn)先上升、后下降的變化趨勢，24 h達(dá)到峰值；鰓、腎和腸中CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6酶活力均呈現(xiàn)先短時間降低、后升高、再降低并趨于穩(wěn)定的趨勢。研究表明，尼羅羅非魚具有一定的碳酸鹽堿環(huán)境適應(yīng)能力，CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6參與碳酸鹽堿脅迫下離子轉(zhuǎn)運、滲透壓平衡調(diào)節(jié)。
　?。?）為了探討碳酸鹽堿環(huán)境中魚體內(nèi) HCO3-代謝和轉(zhuǎn)運相關(guān)機(jī)制，將尼羅羅非魚從淡水直接轉(zhuǎn)入2

7、個碳酸鹽堿度（2.0、4.0 g/LNaHCO3）處理組中進(jìn)行急性脅迫試驗。利用pH計、熒光定量PCR和Western-blotting技術(shù)，分別檢測脅迫0、3、6、12、24、48、72、96和192 h的尼羅羅非魚血清pH、鰓、腎和腸等組織中碳酸酐酶（CAⅡ、CAⅣ）、Na+/HCO3-協(xié)同轉(zhuǎn)運載體（SLC4A4）、Cl-/HCO3-離子交換體（SLC26A6）基因mRNA和蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示：在碳酸鹽堿度脅迫下，隨時間推移

8、，尼羅羅非魚血清pH呈現(xiàn)先升高、后降低的變化趨勢，推測尼羅羅非魚在進(jìn)入高滲環(huán)境后，水環(huán)境中的HCO3-進(jìn)入到血液中，從而引起魚體內(nèi)酸堿平衡的變化，進(jìn)一步導(dǎo)致血液pH升高。熒光定量PCR結(jié)果表明：隨碳酸鹽堿度升高，鰓、腎和腸中的CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4和SLC26A6 mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），相較于鰓和腎，腸中這些基因的mRNA表達(dá)量較低。Western-blotting結(jié)果顯示：淡水和碳酸鹽堿水環(huán)境下，鰓和腎中四種蛋