耶氏酵母POX5基因的改造及其對(duì)γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量的影響.pdf

1、γ-癸內(nèi)酯(gamma-decalaetone，GDL)是一種天然食品香料，隨著人們對(duì)這種安全的天然食品香料需求日益增加，本文嘗試通過(guò)基因敲除的手段敲除耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)基因組中的POX5基因，切斷代謝途徑中消耗γ-癸內(nèi)酯的一條支路，獲得POX5單倍體缺陷菌株，為工業(yè)生產(chǎn)中提高γ-癸內(nèi)酯產(chǎn)量和進(jìn)行多基因缺失菌種改造奠定基礎(chǔ)。
　　 文中使用Cre/loxP系統(tǒng)和KanMX(G418抗性)篩選標(biāo)

2、記建立了酵母POX5基因的敲除方法。從NCBI網(wǎng)站上查到POX5基因和質(zhì)粒pUG6的序列信息，設(shè)計(jì)3對(duì)擴(kuò)增引物以及4對(duì)驗(yàn)證引物。其中合成敲除組件的擴(kuò)增引物游5’末端由60個(gè)與POX5基因上下游同源的核苷酸序列組成；3’末端由20個(gè)和pUG6質(zhì)粒上的loxP位點(diǎn)同源的核苷酸序列。驗(yàn)證引物A，D分別位于POX5基因的上下游；B，C位于kanMX標(biāo)記基因內(nèi)。擴(kuò)增引物通過(guò)擴(kuò)增pUG6質(zhì)粒中的loxP-kanMX-loxP序列組件產(chǎn)生POX5基因

3、敲除序列組件。敲除組件轉(zhuǎn)化到耶氏酵母中后與POX5基因序列上下游同源的60bp序列發(fā)生同源重組，最終以loxP-kanMX-loxP取代基因組中的POX5基因并賦予轉(zhuǎn)化子G418抗性。多種PCR方法反復(fù)驗(yàn)證為正確的陽(yáng)性克隆子后，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化攜帶可賦予Zeocin抗性的質(zhì)粒pSH65，并在含半乳糖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)質(zhì)粒pSH65表達(dá)Cre重組酶，此酶的表達(dá)可以切除兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的kanMX標(biāo)記基因，導(dǎo)致成功切除KanMX的菌株會(huì)失去G418

4、抗性。
　　 PCR檢驗(yàn)中不僅發(fā)現(xiàn)了POX5單倍體缺陷型菌株，而且發(fā)現(xiàn)了有部分耶氏酵母菌突變?yōu)槎扼w，將突變菌在適宜的McClary產(chǎn)孢培養(yǎng)基上誘導(dǎo)二倍體產(chǎn)孢，用2％的蝸牛酶將子囊壁破裂，釋放孢子，篩選成功缺失POX5基因的單倍體耶氏酵母菌。成功菌傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)質(zhì)粒pSH65丟失，最終得到POX5單倍體缺陷型菌株。
　　 成功菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，氣相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中GDL含量。與原始耶氏酵母菌比較，耶羅維亞酵母POX5單