吡唑環(huán)氧烷衍生物3g對結(jié)腸癌細(xì)胞自噬和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和研究目的
　　結(jié)腸癌在在人類常見的癌癥中的被診斷率已經(jīng)躍居第三位。在癌癥的治療中，除了局部切除治療外，化療仍然是一個普遍并有效的方式。許多聯(lián)合給藥的治療方案中，化療藥物都具有一定的毒副作用。篩選新型小分子化合物抑制腫瘤細(xì)胞生長并且研究其具體機(jī)制仍然是研究中的熱點(diǎn)。并且通過化學(xué)遺傳學(xué)的方法研究細(xì)胞程序性死亡和細(xì)胞周期的具體機(jī)制能夠為促進(jìn)藥物開發(fā)，為腫瘤治療打下理論基礎(chǔ)。
　　細(xì)胞程序性死亡可以被分為三大類，凋亡是其中

2、的一個重要類型，在多細(xì)胞生物的正常發(fā)育和穩(wěn)態(tài)保持中有著關(guān)鍵的調(diào)控作用。凋亡是去除不需要的、衰老的和受損的細(xì)胞的重要機(jī)制，凋亡的失調(diào)會導(dǎo)致多種疾病，其中包括癌癥的發(fā)展。自噬是另一類重要的細(xì)胞程序性死亡，在正常條件下可以通過降解多余的細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊的蛋白等，來提供營養(yǎng)用以維持細(xì)胞正常的生命活動。但是在凋亡缺陷性細(xì)胞的死亡中，自噬又是細(xì)胞死亡必需的，這表明了自噬的雙重性。自噬的調(diào)節(jié)是一個精密而復(fù)雜的基因調(diào)控過程，在各階段都受到多種調(diào)節(jié)

3、因子的作用。自噬可以分為mTOR依賴途徑和mTOR非依賴途徑，在前者中主要的分子機(jī)制是通過Akt/mTOR信號通路和其下游底物發(fā)揮作用，并參與調(diào)節(jié)翻譯和細(xì)胞生長。而細(xì)胞自噬和周期也相互聯(lián)系，并且mTOR在其中發(fā)揮重要作用。
　　在我們實(shí)驗室的前期工作中，發(fā)現(xiàn)在除血清和生長因子條件誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過程中，小分子化合物3g通過誘導(dǎo)Ingerinβ4蛋白磷酸化并誘導(dǎo)入核，從而有效地誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。但是其是否能夠在腫瘤細(xì)胞中

4、發(fā)揮抑制生長的作用從而成為一個有效的腫瘤治療藥物則還不清楚。而且其是否會對正常細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響是尋找新型藥物的重點(diǎn)之一，尋找到能夠特異性抑制腫瘤細(xì)胞的化合物能夠為藥物開發(fā)提供新的前景。
　　磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1(PEBP1)，也被稱為Raf激酶抑制蛋白，參與了MAPK，GPCR，NF-κB，GSK3β等多種細(xì)胞生長相關(guān)的信號通路的調(diào)控。PEBP1可以通過參與多種將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化成不同信號以維持細(xì)胞完整性和體內(nèi)平衡的通路。結(jié)腸癌

5、患者的PEBP1啟動子甲基化程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常樣本，這表明了其異常在結(jié)腸癌起始中潛在的重要性。而且最新的研究中PEBP1和LC3的直接相互作用得到了驗證，PEBP1通過保守的LIR基序和LC3結(jié)合并且抑制營養(yǎng)剝奪的自噬，而且是通過PEBP1 S153的磷酸化發(fā)揮作用的。
　　本研究利用化學(xué)遺傳學(xué)的原理與技術(shù)，以化合物小分子3g為研究工具，研究了其特異性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長中的具體分子機(jī)制，確定了其在調(diào)控細(xì)胞自噬和細(xì)胞周期中發(fā)揮的作用，

6、為結(jié)腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)和有效工具。
　　研究方法：
　　1.人結(jié)腸癌Hct116細(xì)胞、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、人肺腺癌A549細(xì)胞、人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人前列腺癌PC3細(xì)胞的培養(yǎng)
　　2.倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　3.SRB法檢測細(xì)胞存活率
　　4.Heochest染色后，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化，從而判斷細(xì)胞是否凋亡
　　5.LDH（乳酸脫氫酶）檢測細(xì)胞是否發(fā)生壞死

7、　　6.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期
　　7.激光共聚焦顯微鏡檢測LC3-Ⅱ的分布
　　8.western blot檢測PARP和caspase-3蛋白切割水平，LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)水平，以及Akt，mTOR，P70S6K，4EBP1，PEBP1的磷酸化水平
　　9.雞胚尿囊膜人移植瘤模型研究小分子化合物對實(shí)體瘤進(jìn)展和正常血管生成的影響
　　研究結(jié)果：
　　1.吡唑環(huán)氧烷衍生物具有對多種腫瘤細(xì)胞的

8、生長抑制作用
　　1.1.SRB檢測結(jié)果表明，小分子化合物3g（1-10μM）作用于多種腫瘤細(xì)胞后，均能顯著抑制細(xì)胞的存活。其中，化合物對結(jié)腸癌細(xì)胞Hct116細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。并且在同樣濃度下不影響正常培養(yǎng)條件的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長。
　　1.2.倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，化合物3g（2.5-10μM）處理Hct116細(xì)胞24h后，細(xì)胞逐漸變圓。而3g處理A549細(xì)胞24h后，細(xì)胞發(fā)生了明顯的拉長。
　　1.3.

9、Heochest染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察化合物3g(2.5-10μM)處理腫瘤細(xì)胞24h后，核凝集現(xiàn)象與對照組相比變化不明顯。
　　1.4流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，化合物3g(5μM)處理Hct116細(xì)胞24 h后，處理組與對照組相比凋亡率沒有發(fā)現(xiàn)顯著升高
　　1.5.Western-blot檢測在12h、24h、48h時3g(5μM)可能不能誘導(dǎo)PARP和caspase-3切割上調(diào)。
　　1.6.LDH檢測發(fā)現(xiàn)，化合物3g(

10、10μM)處理多種腫瘤細(xì)胞48h后，培養(yǎng)液上清中LDH活性沒有顯著性差異，表明細(xì)胞沒有發(fā)生壞死。
　　2.小分子化合物3g通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬和細(xì)胞周期發(fā)揮抑制作用
　　2.1.通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)3g(5μM)處理Hct116細(xì)胞24h后會引起G1期細(xì)胞阻滯。
　　2.2.western blot結(jié)果表明，設(shè)計不同的時間點(diǎn)使用3g(5μM)處理Hct116細(xì)胞后，與對照組相比，3h、6h時Hct116細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)顯

11、著增強(qiáng)，而在48h時自噬流被明顯阻斷。
　　2.3.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，3g(5μM)處理Hct116細(xì)胞3h后，與對照組相比，Hct116細(xì)胞中LC3出現(xiàn)了點(diǎn)狀聚集。
　　2.4.western blot結(jié)果表明，使用3g(5μM)處理Hct116細(xì)胞后，與對照組相比，短時間內(nèi)Hct116細(xì)胞中Akt和mTOR的磷酸化被抑制。
　　2.5.western blot結(jié)果表明，使用3g(5μM)處理Hct116細(xì)胞后，

12、與對照組相比，短時間內(nèi)Hct116細(xì)胞中mTOR的底物P70S6K和4EBP1的磷酸化被抑制。
　　2.6.Western blot結(jié)果表明，使用3g(5μM)處理Hct116細(xì)胞后，與對照組相比，短時間內(nèi)Hct116細(xì)胞中PEBP1的磷酸化被抑制。
　　2.7.雞胚尿囊膜人移植瘤模型在3g處理后，對比對照組，處理組的實(shí)體瘤發(fā)展被明顯抑制，并且不影響其正常血管的發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1.小分子化合物3g能夠顯著

13、抑制多種人腫瘤細(xì)胞存活，且抑制作用呈現(xiàn)濃度的依賴性，其中對Hct116細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，并且在同樣濃度下不影響正常培養(yǎng)液培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.小分子化合物3g不是通過誘導(dǎo)凋亡來抑制Hct116細(xì)胞的生長。小分子化合物3g能夠在短時期內(nèi)誘導(dǎo)自噬，而在長時間時阻斷自噬流，并且發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的作用。其具體分子機(jī)制是通過在短期內(nèi)誘導(dǎo)PEBP1 S153位點(diǎn)的磷酸化，并抑制Akt/mTOR信號通路實(shí)現(xiàn)的。PEBP1的