國產(chǎn)石杉科藥用植物的分子生物學(xué)研究.pdf

1、石杉科(Huperziaceae)植物是一類多年生小型草本植物，土生、附生或生于苔蘚叢中，直立或下垂生長，喜陰涼潮濕環(huán)境。近年來隨著對石杉科植物的開發(fā)和利用，使得石杉科植物資源逐漸減少。因此，對石杉科植物資源有效的合理保護(hù)與科學(xué)的開發(fā)利用工作己迫在眉睫。本文針對這一狀況，為了解決石杉科藥用植物的資源匱乏問題，保證石杉科藥用植物資源的可持續(xù)開發(fā)和利用，進(jìn)行設(shè)計和研究。本論文首先對我國的石杉科植物的生態(tài)狀況、資源情況、分類情況以及石杉堿甲在

2、石杉科植物中的分布、研究狀況、藥理作用等作了詳細(xì)的分析和描述，并著重進(jìn)行如下研究。 1．對石杉科植物的分子生物學(xué)研究利用基因組學(xué)對石杉科藥用植物進(jìn)行研究。通過對不同種石杉科植物的總DNA的提取，選擇葉綠體基因rbcL，rpL16，matK及psbA-trnH間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，通過序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析，結(jié)果闡明了石杉科植物系統(tǒng)位置和分類關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化樹中石杉科與石蔥屬Phylloglosum位于系統(tǒng)樹的姊妹枝，

3、共同組成的進(jìn)化枝與石松科Lycopodiaceae植物平行排列，這一結(jié)果與形態(tài)學(xué)上的分類方法是一致的，支持了將石杉科獨(dú)立于石松科植物的分類觀點(diǎn)。對石杉科的屬下分類，系統(tǒng)進(jìn)化拓?fù)錁浔砻?，該科植物中明顯的包含了兩個進(jìn)化枝，即石杉屬植物進(jìn)化枝和馬尾杉屬植物進(jìn)化枝，這一結(jié)果提示了石杉科植物中兩個屬的劃分的正確性，確立了石杉科植物的系統(tǒng)分類關(guān)系，即石杉屬Huperzia與馬尾杉屬Phlegmariurus的分類方法。這一方法與形態(tài)學(xué)的分類方法相輔

4、相成，這一結(jié)果是對于捷克植物學(xué)家Holub對該屬分類的不確定性的有力的答復(fù)。并對屬下的分類做了進(jìn)一步的研究，系統(tǒng)樹上石杉屬中石杉組和小杉蘭組的植物明顯地被分為兩個聚群，這一結(jié)果同張麗兵、孔憲需的分類學(xué)觀點(diǎn)相一致。由于馬尾杉屬的供試材料不足，其屬內(nèi)系統(tǒng)演化結(jié)果尚不明朗，有待于進(jìn)一步的研究。本研究還確立了長柄石杉應(yīng)為蛇足石杉的一個變種，這一觀點(diǎn)得到了系統(tǒng)樹的支持。伏貼石杉雖然與小杉蘭在形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分，在系統(tǒng)樹上該兩種植物分別聚于不同的演化

5、枝，并有很高的Bootstrap支持率，這一結(jié)果可以明顯的把小杉蘭和伏貼石杉區(qū)分開，伏貼石杉應(yīng)該為一個獨(dú)立的種。 通過對不同基因序列比對并通過遺傳距離及堿基差異的分析，表明了石杉科植物之間存在一定的差別，特別是屬間有較大的差別，為屬間鑒定提供了重要的鑒定依據(jù)。一些形態(tài)上相似難以鑒定的種，如蛇足石杉與長柄石杉；東北石杉、伏貼石杉和小杉蘭之間可以通過堿基差異及遺傳距離的不同進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，為石杉科植物在分子鑒定提供了簡便、可靠的鑒定

6、方法。 2．進(jìn)行了兩種石杉科植物蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對石杉科藥用植物進(jìn)行了研究。為探討石杉科植物中主要有效活性成分石杉堿甲生物合成的途徑奠定了基礎(chǔ)。分析比較了石杉堿甲含量差別較大的東北石杉和伏貼石杉中的蛋白質(zhì)的2-DE表達(dá)譜，優(yōu)化了從石杉科植物中提取純化蛋白質(zhì)的方法。從東北石杉的蛋白質(zhì)表達(dá)譜中分離出蛋白質(zhì)斑點(diǎn)1338個，從伏貼石杉中分出蛋白質(zhì)斑點(diǎn)1269個。273個差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)多集中在分子量在15-75KDa和

7、pH4-7之間。通過對137個成功獲取的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的鑒定，有60個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)鑒定成功。其中在有貢獻(xiàn)的16個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)中，斑點(diǎn)Ha22號蛋白質(zhì)存在于石杉堿甲含量高的伏貼石杉中，而不含石杉堿甲的東北石杉中無此斑點(diǎn)，該蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)為一種絲裂原調(diào)節(jié)蛋白：Mrp3，而在植物體內(nèi)該蛋白質(zhì)的作用機(jī)理尚不清楚，由于該蛋白質(zhì)是存在于兩種石杉堿甲含量明顯不同，但生長環(huán)境和形態(tài)相似的兩個種中的明顯差別蛋白質(zhì)，它的存在有可能與石杉堿甲的生源途徑有一定的相關(guān)

8、性，因而改變了不同的石杉科植物中的石杉堿甲的含量的高低。另外的15個蛋白質(zhì)在兩個種都存在著差異，表明，這些有差異的蛋白質(zhì)都有可能參與了石杉堿甲的生物合成途徑。以上結(jié)果還需要進(jìn)一步的試驗驗證。本實(shí)驗為尋找參與石杉堿甲合成的功能基因或蛋白質(zhì)提供了重要的參考資料。該研究將為對石杉科藥用植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑以及與基因和蛋白質(zhì)的關(guān)系的研究奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。 本文研究在國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報道，屬國際首創(chuàng)。該研究為中藥植物資源的合理開