黑骨藤指紋圖譜及譜效關(guān)系探索性研究.pdf

1、苗藥黑骨藤為蘿藦科（Asclepiadaceae）杠柳屬（Periploca）植物黑龍骨（Periploca forrestii Schltr.）的根莖或全株植物，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版，具有活血、通經(jīng)、解毒、祛風(fēng)等功效，用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)等疾病。主要分布于我國西部、南部及西南地區(qū)，如貴州、廣西、四川、青海、西藏等地。
　　目前，黑骨藤的基礎(chǔ)研究非常薄弱，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀、

2、理化鑒別，缺乏專屬可靠的質(zhì)量控制方法，其發(fā)揮功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，質(zhì)量控制方法和技術(shù)手段落后，與其日益廣泛的應(yīng)用相脫離，嚴(yán)重制約了黑骨藤的深度開發(fā)與利用。鑒于目前的狀況，為了更好地對黑骨藤藥材進(jìn)行品質(zhì)評價，促進(jìn)黑骨藤藥材的深度開發(fā)與利用，本課題以貴州特色苗藥材黑骨藤為研究對象，采用現(xiàn)代分析評價手段對黑骨藤藥材的質(zhì)量評價模式進(jìn)行探索性研究，結(jié)合現(xiàn)代色譜光譜技術(shù)，以及生物學(xué)手段，開展化學(xué)指紋圖譜、生物活性以及基于“譜-效”關(guān)系的有效物

3、質(zhì)初步辨識研究，以期在藥效物質(zhì)辨識和質(zhì)量控制模式方面獲得新的發(fā)展。研究結(jié)果將為黑骨藤藥材的質(zhì)量控制、進(jìn)一步開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。
　　第一部分黑骨藤指紋圖譜研究
　　課題組前期對黑骨藤藥材抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎開展了大量基礎(chǔ)性研究工作，明確了其抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的生物活性部位。本課題采用高效液相色譜法，對課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的黑骨藤藥材抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活性部位（80％乙醇提取物）進(jìn)行指紋圖譜測定方法建立研究，并在《中國藥典》20

4、15年版附錄相關(guān)方法學(xué)驗證指導(dǎo)原則下進(jìn)行了方法學(xué)驗證。在此基礎(chǔ)上，對12批不同產(chǎn)地黑骨藤的80%乙醇提取物進(jìn)行指紋圖譜測定，使用中國藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版進(jìn)行相似度評價。此外，對這12批黑骨藤80%乙醇提取物共有峰峰面積數(shù)據(jù)處理，并應(yīng)用數(shù)理統(tǒng)計軟件 SPSS對12批黑骨藤進(jìn)行聚類分析，分析結(jié)果表明，產(chǎn)地相近的藥材基本上劃歸為一類，這些統(tǒng)計結(jié)果表明黑骨藤提取物的質(zhì)量與其生長環(huán)境很可能有較大關(guān)聯(lián)性。
　　第

5、二部分黑骨藤藥材生物活性研究
　　對12批不同產(chǎn)地黑骨藤的80%乙醇提取物進(jìn)行了抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥理實驗，實驗中采用了弗氏完全佐劑造模大鼠抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（AA）模型，以大鼠足踝關(guān)節(jié)原發(fā)性腫脹直徑、大鼠對側(cè)踝關(guān)節(jié)繼發(fā)性炎癥直徑、大鼠的體重、胸腺、脾、腎上腺、踝關(guān)節(jié)浸出液（腎上腺前列腺素PGE2）為測定指標(biāo)，觀察不同產(chǎn)地的黑骨藤對致病大鼠的影響。造模后給藥組與空白組、模型組比較均有明顯變化（P<0.05），原發(fā)性關(guān)節(jié)炎前期低劑量組均呈

6、現(xiàn)出一定的抑制腫脹作用，高劑量組中相思河、荔波、黔陶產(chǎn)地的黑骨藤提取物藥效作用最為明顯。原發(fā)性關(guān)節(jié)炎后期，低劑量組的情人谷、香紙溝、相思河抑制腫脹較為明顯，高劑量組中相思河產(chǎn)地黑骨藤有較明顯的抗腫脹效果。各大鼠繼發(fā)型關(guān)節(jié)炎腫脹不太明顯，繼發(fā)性反應(yīng)前期，低劑量組中香紙溝、荔波、花溪、黔陶產(chǎn)地的黑骨藤抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎較為明顯，高劑量組中相思河、荔波、花溪產(chǎn)地的黑骨藤效果明顯。在實驗?zāi)┢陔A段，高、低劑量中除相思河、荔波、花溪產(chǎn)地的黑骨藤藥效效果

7、明顯外，高坡產(chǎn)地的抗炎效果也明顯增強(qiáng)。低劑量組中，情人谷、香紙溝、相思河產(chǎn)地組的關(guān)節(jié)浸出液PGE2含量明顯減少。高劑量組中，情人谷、香紙溝、玉林、相思河、開陽、桂林產(chǎn)地組的關(guān)節(jié)浸出液PGE2含量明顯減少。
　　第三部分黑骨藤譜效關(guān)系研究
　　在黑骨藤藥材提取物指紋圖譜和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型藥理數(shù)據(jù)的研究基礎(chǔ)上，使用灰色關(guān)聯(lián)度分析方法對12批不同產(chǎn)地的黑骨藤指紋圖譜與藥效的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，研究黑骨藤的80%乙醇提取物各主要色譜峰

8、對抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥效貢獻(xiàn)大小。分析結(jié)果顯示，12批黑骨藤的80%乙醇提取物有10個共有峰，按關(guān)聯(lián)度大小排序為A2、A10、A8、A1、A4、A6、A7、A5、A3、A9，色譜峰A2、A10、A8號與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥效關(guān)聯(lián)性最大，可能是黑骨藤提取物抗類風(fēng)類關(guān)節(jié)炎作用的有效成分，通過黑骨藤指紋圖譜色譜峰的指認(rèn)，知 A2號色譜峰為綠原酸。
　　第四部分黑骨藤總多酚提取工藝
　　采用超聲輔助提取方法和透明質(zhì)酸酶分解透明質(zhì)酸鈉模型，

9、以總多酚提取率與其抗過敏活性為綜合評價指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用響應(yīng)面法優(yōu)化，對黑骨藤中總多酚提取工藝進(jìn)行了研究。最終得到黑骨藤中總多酚的最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇溶劑濃度為57.33%，超聲時間為33.33 min,溶劑用量為16.11 mL·g-1。在此提取條件下，黑骨藤中總多酚提取率為60.30±0.10 mg·g-1，黑骨藤總多酚抗過敏IC50為32.64±0.09μg·mL-1，結(jié)果提示黑骨藤總多酚具有良好的抗過敏效