ERK5信號通路在成骨細胞凋亡以及小鼠骨質(zhì)疏松癥發(fā)生中的作用.pdf

1、目的：流體剪切應(yīng)力（FSS）可以抑制成骨細胞的凋亡。但是，ERK5在流體剪切應(yīng)力介導(dǎo)的抗成骨細胞凋亡效應(yīng)中的作用還不清楚，ERK5在體內(nèi)對骨代謝平衡的影響也未見報道。因此，對 ERK5信號通路在成骨細胞凋亡和骨質(zhì)疏松中的作用進行研究，能夠為臨床治療骨質(zhì)疏松提供新的治療靶標。
　　方法：將FSS作為激活ERK5的機械刺激，XMD8-92（ERK5特異性抑制劑）或ERK5-siRNA為抑制ERK5活性的干預(yù)措施，分別通過FSS、TNF

2、-α、XMD8-92、ERK5-siRNA單獨或多種干預(yù)后的MC3T3-E1細胞進行Hoechest33258染色、TUNEL特異性凋亡染色、流式細胞技術(shù)來檢測凋亡比率、使用PCR array檢測ERK5下游凋亡相關(guān)的因子變化、使用酶標儀檢測 caspase-3的活性，以及使用Western blotting來檢測各種蛋白的表達變化；對小鼠腹腔注射XMD8-92和/或地塞米松（DEX），觀察小鼠股骨骨組織的微觀結(jié)構(gòu)、力學(xué)性質(zhì)、增殖或凋亡

3、相關(guān)蛋白、以及脂肪細胞數(shù)量的變化。
　　結(jié)果：低濃度（1 ng/ml）的TNF-α對成骨細胞沒有凋亡誘導(dǎo)作用，但是高濃度的TNF-α（10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）可以誘導(dǎo)成骨細胞凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴性。加載生理條件下的FSS（12dyn/cm2）1小時，可以明顯促進成骨細胞內(nèi)的ERK5的磷酸化，磷酸化后的ERK5會從胞漿轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)。5μM的XMD8-92和ERK5-siRNA可以阻斷或者減少成骨細胞內(nèi)FSS

4、介導(dǎo)的ERK5激活。FSS可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡，細胞凋亡率從34.2％減少到13.8%。XMD8-92或者ERK5-siRNA能夠加劇成骨細胞的凋亡，并且能夠逆轉(zhuǎn)FSS的抗成骨細胞凋亡的效應(yīng)。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，XMD8-92能夠抑制成骨細胞內(nèi)Bad的磷酸化，且FSS介導(dǎo)的Bad的磷酸化也能夠被XMD8-92所阻斷。與TNF-α處理組相比，在ERK5-siRNA+TNF-α成骨細胞內(nèi)akt基因表達被抑制，而fasl、bim

5、、caspase-3的基因表達卻被激活。進一步的實驗結(jié)果表明ERK5-siRNA的轉(zhuǎn)染能夠阻斷 FSS誘導(dǎo)的成骨細胞內(nèi) ERK5，AKT，F(xiàn)oxO3a的激活。AKT抑制劑LY294002能夠抑制AKT-FoxO3a信號通路的激活，但不能抑制ERK5的激活。ERK5基因沉默增加了 TNF-α誘導(dǎo)的成骨細胞內(nèi) FasL和 Bim的表達，以及caspase-3的活性；但是，F(xiàn)SS介導(dǎo)的ERK5激活卻能夠下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的成骨細胞內(nèi)FasL和

6、Bim的表達，以及降低caspase-3的活性。體內(nèi)實驗表明，腹腔注射XMD8-92可以抑制小鼠骨組織內(nèi)ERK5的磷酸化；形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)檢測研究表明XMD8-92可以使小鼠骨量減少，并加劇地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松；我們還發(fā)現(xiàn) XMD8-92上調(diào)了小鼠骨組織內(nèi)和成骨細胞內(nèi)的RANKL/OPG的比率和FasL的表達，但是抑制了Cyclin B1和CDK1的表達，從而導(dǎo)致成骨細胞的凋亡增多而增殖減少，引起了骨質(zhì)疏松的發(fā)生；另外。XMD8-92

7、也可以增加小鼠骨組織內(nèi)脂肪細胞的數(shù)量。有趣的是，XMD8-92也同樣加劇了DEX誘導(dǎo)的上述指標的變化。
　　結(jié)論：⑴FSS通過ERK5信號通路抑制成骨細胞凋亡的機制：FSS產(chǎn)生生物學(xué)信號并傳遞至成骨細胞內(nèi)而激活ERK5，磷酸化的ERK5發(fā)生構(gòu)象改變，并轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)；a，磷酸化的ERK5能夠促使Bad發(fā)生磷酸化，激活后的Bad與14-3-3蛋白結(jié)合而被隔離在細胞漿中，并不能被轉(zhuǎn)移至線粒體內(nèi)，從而抑制了Caspas-3的活性。b，活

8、化后的ERK5激活 AKT，磷酸化的AKT進一步促進FoxO3a的磷酸化，磷酸化后的FoxO3a與14-3-3蛋白結(jié)合而被隔離在細胞漿中，從而導(dǎo)致其下游的前凋亡相關(guān)蛋白FasL和Bim的表達減少，最終導(dǎo)致Caspase-3的活性的降低，最終抑制了成骨細胞的凋亡。⑵ERK5參與骨質(zhì)疏松的具體機制有4條：ERK5的失活會導(dǎo)致a，小鼠骨組織內(nèi)RANKL/OPG蛋白表達的比例上調(diào)；b，抑制Cyclin B1/CDK1蛋白的表達，從而使得成骨細胞