STIM1調控成骨細胞分化與絕經(jīng)后骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的機制研究.pdf

1、背景：
　　骨質疏松癥是一種典型的老年性疾病，伴隨著極高的發(fā)病率和死亡率并且顯著的降低患者的生存質量，目前已經(jīng)發(fā)展成為一個普遍的公眾健康問題。骨質疏松癥是以低骨量、骨組織微結構被破壞為特點的疾病，容易導致骨骼脆性增加并且誘發(fā)骨折。其診斷主要依靠骨密度檢查，T值≤-2.5或者伴隨脆性骨折即可確診。在女性人群中，骨質疏松癥和骨折的發(fā)生主要是由于絕經(jīng)后雌激素水平的下降、破骨細胞參與的骨吸收和成骨細胞參與的骨形成之間的平衡被破壞以及骨量減

2、少共同導致的。目前骨質疏松癥的治療方向主要集中在恢復和維持骨吸收和骨形成之間的平衡，臨床上普遍采用藥物治療，包括抑制骨吸收藥物和促進骨形成藥物。除此之外，考慮到鈣在骨代謝和骨平衡中發(fā)揮著重要作用，而且大部分女性的日常鈣攝入量只有推薦攝入量的一半甚至更低，補充鈣劑和維生素D也成為預防和治療骨質疏松癥的一個普遍方法，在臨床治療中廣泛采用。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)補鈣并沒有達到預期的治療骨質疏松癥和預防骨折的效果，不僅如此，還會引起心血管和

3、胃腸道等系統(tǒng)的并發(fā)癥，其潛在的具體原因和作用機制引發(fā)了更多的關注。近來有研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以參與并調控部分鈣通道的功能，我們推測絕經(jīng)后婦女是否因為雌激素缺乏引起部分鈣通道功能失調從而導致鈣離子無法正常出入細胞發(fā)揮作用，因此影響補鈣對骨質疏松癥的預防和治療效果。鈣釋放激活鈣通道（Ca2+release activated Ca2+channel,CRAC）是最近發(fā)現(xiàn)的細胞受體依賴型鈣離子內流鈣通道，可以感受細胞內鈣庫鈣釋放而引起鈣內流，ST

4、IM1和Orai1是其組成部分，分別位于內質網(wǎng)和質膜上，STIM1可以感受內質網(wǎng)鈣庫的釋放并參與調控胞膜Orai1孔隙鈣通道的開放。研究發(fā)現(xiàn)Orai1參與調控成骨細胞和破骨細胞的分化過程，而STIM1在其中的作用和具體功能還有待探索。本研究從絕經(jīng)后骨質疏松癥患者骨髓間充質干細胞成骨分化能力和STIM1表達和功能的狀態(tài)入手，深入探討STIM1參與成骨分化的調控以及雌激素對STIM1的調控及其作用機制。該研究初步探索了鈣釋放激活鈣通道和ST

5、IM1在成骨分化方面的作用和機制，進一步闡述了絕經(jīng)后骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的原因，開闊了臨床中骨質疏松癥治療和預防的思路，提供了新的藥物靶點和治療策略。
　　目的：
　　闡明STIM1調控成骨細胞分化及參與絕經(jīng)后骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的機制
　　方法：
　　1.通過臨床取材獲得并培養(yǎng)絕經(jīng)后骨質疏松癥患者骨髓間充質干細胞，加入成骨誘導液成骨誘導14天，檢測成骨分化關鍵因子Alp、Ocn、Opn和Collagen1的轉錄水平

6、及堿性磷酸酶活性和礦物沉積能力；檢測STIM1表達與鈣離子內流的變化，明確絕經(jīng)后骨質疏松癥患者骨髓間充質干細胞STIM1表達、CRAC功能狀態(tài)以及成骨分化能力有無異常。
　　2.通過構建STIM1穩(wěn)定knockdown細胞模型，在成骨誘導過程中檢測成骨分化關鍵指標Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2、Osterix轉錄水平以及堿性磷酸酶活性和鈣結節(jié)形成能力，明確STIM1在成骨細胞成骨分化和骨形成中的作用。

7、>　　3.采用雌激素刺激小鼠成骨細胞系，檢測STIM1蛋白表達與mRNA轉錄水平，明確雌激素和STIM1之間的聯(lián)系；抑制PI3K-mTOR信號通路活性后，檢測雌激素對STIM1表達的影響，進一步驗證雌激素調控STIM1的具體機制和信號通路。
　　4.通過對STIM1 knockdown細胞模型加入雌激素刺激，檢測成骨誘導過程中成骨分化關鍵因子Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2、Osterix轉錄水平及堿性磷酸酶

8、活性和胞外礦物沉積能力，明確STIM1是否參與雌激素調控的成骨細胞成骨分化過程。
　　結果:
　　1.我們通過臨床手術獲取絕經(jīng)后骨質疏松癥患者的骨髓間充質干細胞分離并培養(yǎng)，在成骨誘導過程中發(fā)現(xiàn)成骨分化關鍵指標Alp、Ocn、Opn和Collagen1轉錄水平以及堿性磷酸酶活性和鈣結節(jié)形成能力均下降，STIM1表達下降并且鈣離子內流減少。提示絕經(jīng)后骨質疏松癥患者骨髓間充質干細胞CRAC狀態(tài)和功能異常，成骨分化能力降低。

9、　　2.我們應用shRNA干擾技術在小鼠MC3T3-E1細胞中成功構建STIM1穩(wěn)定knockdown細胞模型，在成骨誘導過程中發(fā)現(xiàn)抑制STIM1的表達后，成骨分化關鍵指標Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2和Osterix轉錄水平及堿性磷酸酶活性和鈣結節(jié)形成能力均下降，提示STIM1可通過促進鈣內流或其他方式進而促進成骨細胞的分化和功能。
　　3.通過加入雌激素刺激小鼠成骨細胞系我們發(fā)現(xiàn)STIM1的蛋白表達與轉

10、錄水平均升高；通過特異性抑制劑抑制特定信號通路PI3K-mTOR活性后，雌激素失去了對STIM1的上調作用，說明雌激素可以通過PI3K-mTOR信號通路上調STIM1的表達。
　　4.通過構建小鼠MC3T3-E1細胞STIM1穩(wěn)定knockdown細胞模型，我們發(fā)現(xiàn)抑制STIM1表達可明顯阻斷雌激素促進成骨分化關鍵指標Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2和Osterix轉錄及堿性磷酸酶活性和鈣結節(jié)形成能力的作用，

11、提示STIM1參與雌激素調控的成骨分化和骨形成過程。
　　結論:
　　綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)STIM1在成骨細胞的分化和功能中發(fā)揮重要作用，并且參與雌激素調控的成骨分化和骨形成過程。絕經(jīng)后由于雌激素水平下降導致STIM1轉錄水平和表達下降，間接影響了鈣釋放激活鈣通道的功能，降低了成骨細胞的成骨分化和骨形成能力，這可能是絕經(jīng)后骨質疏松癥的發(fā)生發(fā)展原因之一。該研究初步闡明了STIM1在成骨分化和骨形成方面的作用及其機制，可為進