Orai1調(diào)控成骨細(xì)胞分化與凋亡參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　雌激素水平下降導(dǎo)致骨形成和骨吸收失衡是誘發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可引起骨的脆性增加和骨的強(qiáng)度降低,并最終導(dǎo)致容易發(fā)生骨折,嚴(yán)重影響中老年婦女的健康。恢復(fù)和維持骨形成與骨吸收的平衡是目前骨質(zhì)疏松研究和治療的焦點。之前的研究主要集中在抑制破骨細(xì)胞活性以減少骨吸收,但近年來成骨細(xì)胞的分化或凋亡異常導(dǎo)致骨量減少越來越受到人們的重視。骨質(zhì)疏松癥的研究方向已逐漸從單一抑制破骨細(xì)胞活性轉(zhuǎn)移至多向研究成骨

2、細(xì)胞與破骨細(xì)胞的功能及其調(diào)控機(jī)制,以重新平衡骨形成與骨吸收過程。成骨細(xì)胞的功能恢復(fù)和數(shù)目維持已成為目前骨質(zhì)疏松癥治療的研究重點。因此,深入研究調(diào)控成骨細(xì)胞骨形成能力的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)具有促成骨作用的藥物靶點,將會為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的策略和新的方法。Orai1是最近發(fā)現(xiàn)和鑒定的介導(dǎo)細(xì)胞受體依賴型鈣離子內(nèi)流的鈣通道,是一個四次跨膜蛋白。研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠Orai1基因后,小鼠出現(xiàn)體型減小、骨皮質(zhì)變薄、松質(zhì)骨減少等成骨不全癥狀,提示鈣

3、通道 Orai1的異?？赡軈⑴c骨形成過程。然而Orai1介導(dǎo)骨形成的具體分子機(jī)制尚未見報道。本研究從Orai1調(diào)控成骨細(xì)胞的分化與凋亡入手,深入探討Orai1調(diào)控骨形成的分子機(jī)制。該研究明確了Orai1在骨形成方面的作用及其機(jī)制,可為臨床骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的藥物靶點和新的策略。
　　目的:
　　闡明Orai1調(diào)控成骨細(xì)胞分化與凋亡參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制
　　方法:
　　1.通過去勢法構(gòu)建小鼠絕經(jīng)后

4、骨質(zhì)疏松癥模型,檢測成骨細(xì)胞 Orai1表達(dá)與鈣離子內(nèi)流變化;通過構(gòu)建Orai1穩(wěn)定knockdown細(xì)胞模型,檢測成骨關(guān)鍵指標(biāo)ALP、OCN、OPN、Runx2和Osterix轉(zhuǎn)錄及ALP活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力,并檢測鈣離子依賴的Ras-ERK1/2與CaMKII-NF-ATc信號通路活性,明確Orai1是否參與調(diào)控成骨細(xì)胞骨形成過程。
　　2.17β-E2刺激小鼠MC3T3-E1細(xì)胞,檢測Orai1蛋白表達(dá)與mRNA轉(zhuǎn)錄水平,并

5、檢測AKT-mTOR信號通路活性;應(yīng)用特異性抑制劑抑制AKT與mTOR活性后,檢測17β-E2對Orai1蛋白表達(dá)與mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響,明確雌激素調(diào)控Orai1的機(jī)制。17β-E2誘導(dǎo)Orai1 knockdown細(xì)胞模型成骨,檢測成骨關(guān)鍵指標(biāo)ALP、OCN、OPN、Runx2和Osterix轉(zhuǎn)錄及 ALP活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力,并檢測鈣離子依賴的Ras與CaMKII信號通路活性,明確雌激素可否通過Orai1促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

6、　　3.Tg誘導(dǎo)成骨細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后,檢測17β-E2對細(xì)胞凋亡、Caspase-12和Caspase-3的活性及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性分子Grp78與CHOP表達(dá)的影響,明確17β-E2可否抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下檢測17β-E2對調(diào)控Grp78轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ATF6、YY1、IRE1和TFII-I及Ras-ERK1/2信號通路影響,明確17β-E2抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　4.B

7、MP2誘導(dǎo)Orai1 knockdown細(xì)胞模型成骨,檢測成骨關(guān)鍵指標(biāo)ALP、OCN、OPN、Runx2和Osterix轉(zhuǎn)錄及 ALP活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力,并檢測鈣離子依賴的Ras與CaMKII信號通路活性,明確BMP2可否通過Orai1促進(jìn)骨形成。BMP2誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化后,檢測調(diào)控Orai1表達(dá)或活性的關(guān)鍵信號分子活性,并加入相應(yīng)信號通路抑制劑,明確BMP2調(diào)控Orai1的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.我們應(yīng)用去勢法構(gòu)

8、建小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型并發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥小鼠成骨細(xì)胞Orai1表達(dá)下降并且鈣離子內(nèi)流減少。接著我們應(yīng)用shRNA干擾技術(shù)在人MG63和鼠MC3T3-E1細(xì)胞中成功構(gòu)建Orai1穩(wěn)定knockdown細(xì)胞模型,我們發(fā)現(xiàn)抑制Orai1的表達(dá)后,成骨關(guān)鍵指標(biāo)ALP、OCN、OPN的轉(zhuǎn)錄以及ALP活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力均下降,并且調(diào)控成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix轉(zhuǎn)錄以及鈣離子依賴的Ras-ERK1/2與CaMKI

9、I-NF-ATc信號通路活性也顯著抑制,提示Orai1通過促進(jìn)鈣離子內(nèi)流激活Ras-ERK1/2與CaMKII-NF-ATc信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成過程。
　　2.我們用17β-E2刺激MC3T3-E1細(xì)胞發(fā)現(xiàn)Orai1蛋白表達(dá)與mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈時間依賴性增加,并且發(fā)現(xiàn)17β-E2可明顯促進(jìn)AKT與mTOR的活性增加。我們用特異性抑制劑抑制AKT與mTOR活性后,阻斷了17β-E2促進(jìn)成骨細(xì)胞Orai1表達(dá)的作用,提示17β-

10、E2通過激活A(yù)KT-mTOR信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞Orai1的表達(dá)。初步揭示了雌激素降低導(dǎo)致成骨細(xì)胞Orai1表達(dá)降低的分子機(jī)制。我們還發(fā)現(xiàn)抑制Orai1表達(dá)可明顯阻斷17β-E2促進(jìn)成骨關(guān)鍵指標(biāo) ALP、OCN、OPN的轉(zhuǎn)錄以及促進(jìn) ALP活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力的作用,并阻斷17β-E2促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix轉(zhuǎn)錄以及激活Ras與CaMKII信號通路的作用,提示17β-E2通過促進(jìn)Orai1表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)

11、胞成骨分化。
　　3.我們發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下17β-E2通過促進(jìn)Grp78表達(dá),抑制Caspase-12和Caspase-3的活性抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)17β-E2通過促進(jìn)Orai1表達(dá),激活Ras-ERK1/2信號通路,促進(jìn)TFII-I的磷酸化并入核與Grp78啟動子區(qū)結(jié)合,促進(jìn)Grp78表達(dá)。該研究揭示了Orai1參與調(diào)控成骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　4.我們發(fā)現(xiàn)在BMP2促成骨誘導(dǎo)條件

12、下,下調(diào)Orai1表達(dá)可抑制成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix的轉(zhuǎn)錄,并進(jìn)一步抑制成骨標(biāo)志性分子ALP、OCN和OPN的轉(zhuǎn)錄,從而抑制了成骨細(xì)胞的成骨分化能力。我們還發(fā)現(xiàn)下調(diào)Orai1表達(dá)可抑制BMP2促進(jìn)的鈣離子內(nèi)流以及鈣離子依賴的Ras和CaMKII信號通路的激活,從而抑制成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix轉(zhuǎn)錄,以及成骨標(biāo)志性分子ALP、OCN和OPN的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BMP2通過激活I(lǐng)ntegrinβ1-F

13、AK-Src信號通路促進(jìn)Orai1活化和鈣離子內(nèi)流以及 Ras和CaMKII信號通路的激活,促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和細(xì)胞外礦物鈣化過程。并且證實Integrinβ1與BMP2受體BMPR-I和BMPR-II在細(xì)胞膜上存在直接的相互作用。初步揭示了BMP2調(diào)控Orai1活性促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制。
　　結(jié)論:
　　綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后由于雌激素水平下降,AKT-mTOR信號通路活性降低導(dǎo)致Orai1表達(dá)下降。Orai1表達(dá)