隱球菌通過S100A10活化尿激酶-纖溶酶系統(tǒng)侵襲血腦屏障的機制研究.pdf

1、隱球菌一種機會致病菌，一般分布于環(huán)境土壤中，不寄居于人體。近年來，隱球菌侵犯人類每年新增的隱球菌病人全球共高達百萬人，尤其是侵犯人腦血腦屏障后，死亡率很高，治療比較困難。人類的腦微血管內皮細胞中一類蛋白，S100A10蛋白是鈣結合蛋白家族中S100蛋白中的一種，分子量大小為11KD，也稱p11蛋白。在細胞液和細胞核中都有存在，經常與膜聯(lián)蛋白A2結合作為跨膜蛋白在維持細胞正常生理活動中起到重要的作用。人體內環(huán)境血液系統(tǒng)中含有微量的未激活的

2、纖溶酶原，而內皮細胞中的S100A10蛋白可以結合未被激活的纖溶酶原蛋白，通過改變纖溶酶原蛋白的空間位象，起到催化使其更加容易被尿激酶(UPA)激活的一種橋梁性的作用。研究也表明隱球菌和腦微血管內皮細胞共孵育后，S100A10在mRNA水平升高。S100A10在細胞膜上的位置與尿激酶受體的空間位置非常接近，隱球菌通過上調細胞的S100A10的基因表達使隱球菌莢膜表面結合的纖溶酶原更多的被催化，使其更加容易被激活，并且細胞膜上的S100A

3、10蛋白結合隱球菌上的纖溶酶原時，距離尿激酶受體很近。在隱球菌侵襲細胞時，有國外研究文獻證明隱球菌可以在沒有組織纖溶酶原(tPA)存在的時候下，使細胞自身表達尿激酶，從而尿激酶將尿激酶受體附近的經S100A10催化過的大量纖溶酶原激活為有活性的纖溶酶，進而纖溶酶破壞細胞外基質層，使隱球菌通過細胞旁路途徑更易通過血腦屏障。本實驗就隱球菌和腦微血管內皮細胞共孵育后的S100A10的作用，進行進一步的研究和論證。
　　目的：
　　

4、證明隱球菌可以通過小鼠腦微血管內皮細胞S100A10基因的上調來活化尿激酶-纖溶酶系統(tǒng)，進而隱球菌可以更容易的穿過血腦屏障。
　　方法：
　　第一部分:設置實驗組和對照組，用小鼠血管內皮細胞bEnd.3和新生隱球菌B3501株共孵育，孵育時間為0h、2h、4h、8h、16h、24h，進行Real-time Quantitative PCR和Western-blot分別檢測S100A10和尿激酶分別在mRNA水平和蛋白水平的表

5、達量。
　　第二部分:進行慢病毒質粒的構建、檢測感染效率，摸索bEnd.3細胞最佳的感染條件，并且用Real-time Quantitative PCR和Western-blot檢測沉默S100A10基因后，尿激酶基因和S100A10基因共同在mRNA水平和蛋白水平的表達量。
　　第三部分:設置沉默S100A10后的小鼠血腦屏障transwell體外模型為實驗組，未沉默S100A10基因的正常bEnd.3細胞為對照組，分別和

6、野生型B3501株進行孵育實驗，檢測通過模型菌的量。用底物顯色試劑S-2444和S-2251檢測尿激酶-纖溶酶系統(tǒng)的相關活化情況。
　　結果：
　　第一部分共孵育的時間越長，S100A10和UPA基因在mRNA水平和蛋白表達水平的量也越高。其中S100A10在2h、16h、24h組在mRNA差異明顯，t檢驗，P＜0.05;S100A10蛋白在24h組有差異性，t檢驗，P＜0.05; UPA基因在16h、24h組的mRNA與對

7、照組有明顯差異，經t檢驗，p＜0.05; UPA蛋白在8h、16h、24h組與對照組有明顯差異，經t檢驗，p＜0.05。
　　第二部分構建S100A10基因慢病毒后，發(fā)現(xiàn)其感染bEnd.3細胞在MOI值為20時為最佳有效值且bEnd.3細胞形態(tài)正常;沉默S100A10基因后，S100A10基因和UPA基因在mRNA水平和蛋白水平分別對應相應的正常對照組均下降，且有明顯的差異，經t檢驗，P值均＜0.05
　　第三部分 S100

8、A10正常組和沉默組分別構建的Transwell模型，通過模型的菌落數隨著共孵育的時間延長，總體趨勢是增加的。尤其是菌落數在8h組、16h組、24h組有明顯的差異性經t檢驗p＜0.05;與此同時在被新生隱球菌激活各組的尿激酶和纖溶酶的量也有顯著差異性，纖溶酶蛋白組在8h、16h、24h三個時間點有明顯差異，t體檢P＜0.05;尿激酶蛋白組在16h、24h兩個時間組有明顯差異，經t檢驗，P＜0.05
　　結論：
　　隱球菌能通