尿激酶與阿替普酶在大鼠腦出血后血腫纖溶治療中的作用及機制研究.pdf

1、腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)病死率致殘率高，是最具破壞的卒中類型。據(jù)一項2017年發(fā)表的全國性調(diào)查統(tǒng)計顯示，我國每年卒中的年齡標準化發(fā)病率為246.8/10萬人，其中ICH占了23.8％，遠高于大多數(shù)西方國家。然而，ICH的致傷機制尚未完全明確，ICH后血腫的物理壓迫及繼發(fā)的血腫旁水腫(perihematomal edema，PHE)形成，均可影響患者預(yù)后。因此，及時清除血腫，以減輕原發(fā)和繼發(fā)損傷，

2、在ICH治療中顯得尤為重要。
　　然而，受血腫部位及手術(shù)本身創(chuàng)傷所限，開顱血腫清除術(shù)并不總適用。與傳統(tǒng)手術(shù)相比，微創(chuàng)手術(shù)聯(lián)合血腫腔內(nèi)纖溶藥物注射治療對正常腦組織創(chuàng)傷小，療效好，適用更廣，近年來得到關(guān)注并逐步發(fā)展起來，成為ICH較有前景的治療措施。
　　目前，該措施中最廣泛使用的纖溶藥物是阿替普酶，即組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)。tPA可有效溶解血腫，在IC

3、H后血腫纖溶治療中療效受到多項臨床試驗的認可。然而，有動物實驗發(fā)現(xiàn)，tPA在輔助清除血腫的同時，存在促進水腫形成、增加炎癥反應(yīng)、促進神經(jīng)毒性等副作用。這些報道使tPA在顱內(nèi)纖溶治療的應(yīng)用受到了質(zhì)疑。尿激酶，全稱尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)，作為一個纖溶老藥（1999年后因停產(chǎn)退出美國市場），在我國廣泛應(yīng)用于ICH后血腫纖溶治療。在部分幕上腦出血，微創(chuàng)手術(shù)聯(lián)合血

4、腫腔內(nèi)uPA注射治療已達成專家共識，為A級推薦。然而，由于對于uPA和tPA這兩種纖溶藥物在ICH后血腫纖溶治療應(yīng)用上缺少臨床前或臨床研究，藥物的選擇仍憑借經(jīng)驗。
　　為了探索uPA與tPA在大鼠腦出血后血腫纖溶治療中的作用及機制，本研究采用大鼠自體血注射誘導(dǎo)腦出血模型，從兩部分進行研究:第一部分觀察uPA和tPA在大鼠ICH后血腫纖溶治療的作用，包括纖溶療效及對PHE的影響;第二部分則通過檢測血腦屏障(blood-brain b

5、arrier，BBB)相關(guān)指標，對藥物于BBB的效應(yīng)及機制進行研究。
　　一、尿激酶與阿替普酶在大鼠腦出血后血腫纖溶治療中的作用
　　目的:
　　以大鼠ICH模型為基礎(chǔ)，分別給予uPA和tPA血腫腔內(nèi)注射處理，3天后檢測血腫體積、PHE范圍、腦水含量(brain water content，BWC)、BBB通透性及動物行為學(xué)，觀察uPA和tPA在ICH后血腫纖溶治療的療效。
　　方法:
　　實驗動物隨機分為

6、5組，即sham組、ICH組、ICH+saline組、ICH+tPA組和ICH+uPA組，每組14只。術(shù)后30分鐘，ICH+saline組、ICH+tPA組和ICH+uPA組分別于血腫中心給予2μl體積的saline、tPA(10μg/μl)、uPA(100IU/μl)，sham組為空白對照組，只進針不注血，ICH組只注血不給藥。術(shù)后第三天，實驗動物進行轉(zhuǎn)角實驗和前肢放置實驗以做行為學(xué)評分，后行磁共振掃描以測算血腫體積及PHE范圍。掃描

7、完成后，每組中8只測量BWC以評估水腫程度，剩余6只行伊文斯藍(evans blue，EB)滲出實驗以檢測BBB通透性。
　　結(jié)果:
　　1.磁共振圖像分析發(fā)現(xiàn)，uPA與tPA血腫腔內(nèi)注射均可有效縮小血腫體積和PHE范圍，且uPA減少PHE范圍的作用更加顯著(uPA vs tPA，p＜0.05)。此外，BWC的測量結(jié)果顯示，uPA可減輕患側(cè)半球水含量，而tPA組與對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.轉(zhuǎn)角實驗和前肢放置試驗結(jié)

8、果顯示uPA可顯著改善大鼠ICH后神經(jīng)功能，而tPA對于神經(jīng)功能改善未達統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　3.uPA與tPA均有效減小了EB染料血管外滲出，提示兩種纖溶藥物在穩(wěn)定ICH后BBB通透性上具有積極作用。
　　結(jié)論:
　　大鼠ICH后血腫腔內(nèi)uPA或tPA注射均可縮小血腫體積及PHE范圍，對于減少出血后BBB損傷具有一定積極作用。
　　二、尿激酶與阿替普酶對腦出血后血腦屏障的效應(yīng)及機制研究
　　目

9、的:
　　建立大鼠ICH模型，觀察給藥后，BBB相關(guān)緊密連接蛋白(claudin-5、ZO-1)及細胞基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達情況，探討uPA與tPA對BBB的保護作用及機制。
　　方法:
　　實驗動物隨機分3組，即ICH+saline組、ICH+tPA組和ICH+uPA組，每組18只。分別于術(shù)后30分鐘于血腫中心給予2μl體積的saline、tPA(10μg

10、/μl)、uPA(100IU/μl)。術(shù)后第三天，實驗動物（5/組）通過免疫熒光染色檢測BBB相關(guān)緊密蛋白(ZO-1，Claudin-5)的表達，另外，ZO-1還采用蛋白質(zhì)印跡(western blot，WB)法(4/組)進行定量比較;采用WB及實時聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測MMPs(4/組)的表達;采用WB（5/組）檢測平p65與磷酸化p65(p-p65)水

11、平，通過p-p65/p-65間接反映NF-κB通路活性。
　　結(jié)果:
　　1.通過對血腫周圍ZO-1表達檢測(免疫熒光，WB)和血腫周圍及水腫區(qū)皮質(zhì)的claudin-5免疫染色，發(fā)現(xiàn)uPA與tPA均可上調(diào)這兩種BBB相關(guān)緊密連接蛋白表達，提示兩種藥物對維持BBB完整性有積極作用。
　　2.RT-PCR及WB結(jié)果顯示，給藥組有效降低了大鼠ICH后MMP-12表達，此外，uPA還降低了MMP-2的表達，而tPA對于MMP-