硫礦硫化葉菌P2分子伴侶的ATPase活性對其功能影響.pdf

1、Ⅱ型分子伴侶廣泛存在于古細(xì)菌和真核生物胞液中，他們能夠在體內(nèi)外促進(jìn)蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊，有效地抑制變性蛋白質(zhì)的聚集，具有重要作用。 硫礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus）P2是一種典型的泉古菌門硫化葉菌屬嗜熱古菌，具有良好的耐高溫性能，但其分子伴侶研究在國際上未見報道，本實驗室首次報道克隆表達(dá)了該菌分子伴侶基因并證實了其分子伴侶是由不同的亞基組成的8元旋轉(zhuǎn)對稱雙環(huán)結(jié)構(gòu)，具有分子伴侶功能功能[6]，發(fā)現(xiàn)該

2、分子伴侶具有明顯ATPase活性。但ATP對古菌P2分子伴侶功能影響至今未見任何報道。 本研究以硫礦硫化葉菌P2β分子伴侶為研究對象，通過與其他Ⅱ型分子伴侶序列的保守性比對及空間結(jié)構(gòu)尋找與ATPase活性有關(guān)的位點，利用重疊延伸PCR技術(shù)成功構(gòu)建P2分子伴侶基因定點突變，將該分子伴侶的Asp104突變成Arg104，Ala418突變?yōu)門hr，并將這個突變基因在大腸桿菌BL21（DE3）中實現(xiàn)了高效表達(dá)，獲得ATPase活性變化的

3、分子伴侶突變體。在此基礎(chǔ)上，對突變分子伴侶蛋白的性質(zhì)與功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 硫礦硫化葉菌P2分子伴侶突變表達(dá)工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，所收集的菌體用超聲波破碎。破碎后的上清經(jīng)75℃高溫處理30 min去除大量雜蛋白，再經(jīng)80%飽和度的（NH4）2S04鹽析以及Resouce Q離子柱層析純化后，得到了突變分子伴侶的單體。純化后的分子伴侶單體，在ATP和Mg2+存在的條件下經(jīng)過5h可聚合成典型的雙層面包圈結(jié)構(gòu)的分子伴侶八聚體

4、。利用孔雀石綠方法，在不同溫度下對兩個突變體進(jìn)行分子伴侶ATPase測定，結(jié)果表明一個突變體ATPase活性喪失，另一個ATPase活性增加，可見我們設(shè)計的基因突變位點確實與ATPase活性有關(guān)。以綠色熒光蛋白（GFP）為研究對象，分析P2分子伴侶野生型及突變型對酸變性蛋白重新折疊的促進(jìn)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該分子伴侶ATPase活性增加的突變體對外源GFP的復(fù)性與野生型相比具有更為明顯的促進(jìn)作用，而ATPase活性喪失的突變體則不能促進(jìn)GFP

5、的折疊。以檸檬酸合酶為研究對象，分析該P2分子伴侶對外源蛋白熱聚集的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該分子伴侶防止外源蛋白聚集的作用與ATPase有關(guān)。 本研究表明：硫礦硫化葉菌P2分子伴侶104位的天冬氨酸和418位的丙氨酸是影響該型古菌分子伴侶對ATP結(jié)合和水解能力的關(guān)鍵位點，它們的突變可以引起ATPase活性的變化。在失去ATPase活性后，P2分子伴侶同時也失去了介導(dǎo)變性熒光蛋白GFP重新折疊復(fù)性的能力；同時也不再具有提高檸檬酸合酶抗熱聚