CD137分子對小鼠血管鈣化的影響.pdf

1、目的：
　　探討CD137分子對載脂蛋白E基因敲除小鼠（Apo E-/-小鼠）動脈粥樣斑塊及血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）鈣化的影響。
　　方法：
　　本實驗包括體內(nèi)實驗和體外實驗兩部分。（1）體內(nèi)實驗：Apo E-/-小鼠給予高脂飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化及鈣化模型，分別用刺激型CD137抗體、抑制型CD137抗體激活或抑制CD137分子。對各組小鼠主動脈行組織形態(tài)學(xué)

2、分析并予Masson染色及ALP染色，用Von kossa染色比較各組斑塊鈣化程度、免疫組化染色檢測斑塊中骨形成蛋白-2（Bone morphogenetic protein2，BMP-2）及Runx2蛋白表達水平。（2）體外實驗：采用組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)C57BL/6J小鼠主動脈VSMCs，免疫熒光染色鑒定細(xì)胞純度；用β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)VSMCs鈣化，以刺激型CD137抗體、抑制型CD137抗體激活或抑制CD137分子；細(xì)胞鈣化及細(xì)

3、胞內(nèi)鈣離子含量分別采用von kossa染色和甲基百里香酚藍法檢測，采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測各組VSMCs骨形成相關(guān)蛋白BMP-2和Runx2 mRNA的表達水平、蛋白印跡法（Western blot）檢測BMP-2、Runx2蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　?。?）各組內(nèi)均可見小鼠主動脈內(nèi)膜增厚及粥樣斑塊形成。給予刺激型CD137抗體激活CD137分子后，小鼠粥樣斑塊及鈣化面積增加，血管壁肌纖維減少，斑塊內(nèi)

4、見大量圓形或橢圓形、胞質(zhì)嗜堿性的骨樣細(xì)胞生成；而同時給予抑制型CD137抗體可部分逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象。
　　（2）ALP染色結(jié)果顯示，ALP在鈣鹽沉積部位活性較高，CD137刺激組斑塊內(nèi)ALP活性較對照組明顯升高；而CD137抑制組斑塊內(nèi)ALP活性較刺激組下降。
　?。?）免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，對照組粥樣斑塊中BMP-2、Runx2表達較低；CD137刺激組BMP-2和Runx2的表達顯著增加；而CD137抑制組BMP-2、R

5、unx2的表達量與CD137刺激組相比有所下降。
　?。?）組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)的小鼠VSMCs可見“谷峰樣”生長；第3代細(xì)胞經(jīng)免疫熒光鑒定其純度達95％。
　?。?）VSMCs經(jīng)刺激型CD137抗體處理后，VSMCs的鈣化較對照組而言明顯加重；而經(jīng)過額外的抑制型CD137抗體預(yù)處理后，刺激型CD137抗體的這種加強VSMCs鈣化的作用被削弱。
　?。?）CD137刺激組VSMCs鈣含量和ALP活性較對照組增加（分別

6、為P<0.01，P<0.05），而CD137抑制組VSMCs鈣含量、ALP活性較刺激組均下降（分別為P<0.01，P<0.05）。
　　（7）刺激型CD137抗體處理 VSMCs后，細(xì)胞內(nèi)BMP-2、Runx2的mRNA及蛋白表達水平較對照組升高；予抑制型CD137抗體預(yù)處理后，BMP-2、Runx2 mRNA及蛋白表達水平較刺激組下降。
　　結(jié)論：
　?。?）激活CD137能夠促進ApoE-/-小鼠粥樣斑塊及VSMC