通過(guò)制備小鼠單克隆抗體篩選和研究胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物.pdf

1、ES細(xì)胞及其體外分化模型能夠模擬胚胎正常發(fā)育進(jìn)程，在發(fā)育生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)、克隆動(dòng)物、動(dòng)物和人類疾病模型的建立、藥物的開(kāi)發(fā)和篩選、基因治療、細(xì)胞組織和器官的修復(fù)和移植治療等方面都有廣泛的應(yīng)用前景。目前常用于胚胎干細(xì)胞鑒別及質(zhì)量控制的表面標(biāo)記主要有糖脂類SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4以及蛋白多糖類TRA-1-60、TRA-1-81、GCTM2等，這些表面標(biāo)記最初是通過(guò)畸胎瘤或胚胎免疫獲得單克隆抗體后篩選得到的。OCT4、N

2、ANOG等轉(zhuǎn)錄因子的標(biāo)志物抗體則直接使用蛋白作為免疫原免疫動(dòng)物所獲得的。然而這些標(biāo)志物的特異性有一定的局限性:它們?cè)谝恍┏审w干細(xì)胞、正常組織或癌細(xì)胞中也有一定表達(dá)，胚胎干細(xì)胞特異性的膜表面標(biāo)志數(shù)量更是有限。因此發(fā)現(xiàn)新的ES細(xì)胞功能性分子及特異性標(biāo)志物至關(guān)重要。
　　本研究利用小鼠單克隆抗體技術(shù)篩選蛋白質(zhì)組學(xué)提示的候選標(biāo)志物分子，從100余個(gè)未經(jīng)功能注釋的hES新膜表面蛋白挑選30個(gè)，表達(dá)重組蛋白，免疫BALB/c小鼠，通過(guò)WB篩選

3、陽(yáng)性克隆，獲得一組針對(duì)重組蛋白陽(yáng)性的小鼠單克隆抗體組。再通過(guò)hES的ICC染色鑒定，獲得9個(gè)hES染色陽(yáng)性的抗體。通過(guò)ICC免疫熒光染色和IHC組織芯片的檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)GRAMD1A蛋白特異性表達(dá)于多種上皮細(xì)胞，可以作為一種新的廣泛性上皮細(xì)胞標(biāo)志物，在再生醫(yī)學(xué)和腫瘤診斷上是非常有價(jià)值的。
　　接著，我們利用小鼠單克隆抗體反向篩選mES標(biāo)志物。將小鼠胚胎干細(xì)胞（全細(xì)胞）免疫BALB/c小鼠，通過(guò)ICC篩選，獲得大量針對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞

4、染色陽(yáng)性的雜交瘤。其中6個(gè)單克隆抗體針對(duì)mESC染色較為特異，并通過(guò)流式分析進(jìn)一步確定了這6個(gè)抗體對(duì)應(yīng)的抗原隨著mESC的自發(fā)分化都有顯著下降。然后采用免疫共沉淀的方法純化抗原，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)鑒定到其中一個(gè)蛋白是核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，NPM/B23對(duì)于胚胎發(fā)育和維持基因組穩(wěn)定性是必需的，NPM1基因失活可導(dǎo)致無(wú)限制的中心體復(fù)制和基因組失穩(wěn)。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NPM1廣泛分布于成體組織，且在

5、大部分的腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，隨著ES的自發(fā)分化表達(dá)量下降，與已有的文獻(xiàn)結(jié)果相符合。抗體B3-C1針對(duì)的抗原特異性表達(dá)于未分化的mES，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示其主要表達(dá)于睪丸的初級(jí)精母細(xì)胞和子宮的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，很可能是一種新的干細(xì)胞特異性標(biāo)志物。雖然目前還無(wú)法鑒定其對(duì)應(yīng)的蛋白，但是這個(gè)抗體作為于細(xì)胞鑒定的一種工具還是非常有意義的。
　　Zinc finger and SCAN domain-containing4(Zscan4)基因

6、最初被鑒定是在小鼠著床前胚胎的二細(xì)胞期特異性表達(dá)。Zscan4在小鼠ES細(xì)胞里的表達(dá)是瞬時(shí)、可逆的。其特有的表達(dá)模式表現(xiàn)為，只有1-5％的ES細(xì)胞在同一時(shí)間表達(dá)該基因。在小鼠胚胎干細(xì)胞中敲除基因Zscan4后，小鼠胚胎干細(xì)胞的ALT過(guò)程被抑制，細(xì)胞端粒長(zhǎng)度在六代內(nèi)下降了30％。同時(shí)，胚胎干細(xì)胞的核型正常率由88％下降到65％，細(xì)胞分裂逐漸停滯，凋亡細(xì)胞的比例顯著上升。Zscan4基因?qū)τ陂L(zhǎng)期維護(hù)mES細(xì)胞潛能起著積極作用。根據(jù)這個(gè)提示，