富氫鹽水對腦死亡豬肝臟NF-κB及Nrf2-HO-1表達的影響.pdf

1、目的：腦死亡供肝為終末期肝病患者的新生帶來了希望，對腦死亡供體器官進行適當維護可最大限度的利用緊缺的器官資源。氫氣的生物學作用研究近年來是醫(yī)學領域比較熱門的一個課題，其選擇性抗氧化、抗炎癥的特性如今已在臨床得到初步的應用，但是目前幾乎沒有關于氫氣對腦死亡大動物器官維護的研究。本研究旨在通過間斷緩慢顱內加壓法建立五指山小型豬的腦死亡模型，并予富氫鹽水（HS）進行干預治療。檢測腦死亡五指山小型豬經HS干預治療后血清谷草轉氨酶（AST）、谷丙

2、轉氨酶（ALT）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）水平，肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量，以及NF-κB p65、Nrf2、HO-1的表達情況，并觀察肝組織標本光鏡及電鏡下的變化。探討HS對腦死亡肝臟損傷的干預作用及其機制，為腦死亡供肝的維護提供理論支持。
　　方法：選擇健康雄性五指山小型豬18只，隨機分為三組（n=6）：假手術組（K組）、腦死亡組（B

3、組）、HS干預組（H組）。動物經麻醉誘導后依次行氣管插管、膀胱造瘺、頸動靜脈置管、顱骨鉆孔置入20F Foley氣囊導管。B組、H組建立腦死亡模型，并維持其腦死亡狀態(tài)24h。K組僅顱內置入水囊，不建立腦死亡模型，維持麻醉狀態(tài)；H組動物從判斷腦死亡開始，于上腔靜脈輸入HS，B組輸入當量的生理鹽水。B組、H組在初判腦死亡后3h、6h、12h、18h、24h分別采集血液及肝組織標本。K組以顱內置管后3h作為起始時間，在起始時間點后3h、6h、

4、12h、18h、24h分別采集血液及肝組織標本。血清標本檢測AST、ALT濃度，HE染色觀察肝組織病理學改變，電鏡觀察肝組織超微結構改變；用相應試劑盒檢測肝組織中MDA、SOD含量；酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測定血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、 IL-6的水平；DAB免疫組織化學染色檢測各組肝組織內6h、12h、24h，三個時間點的NF-κB p65蛋白以及Nrf2、HO-1的表達水平差異。利用Western bolt檢測肝內

5、6h、12h、24h,NF-κBP65分子的表達量以及Nrf2、HO-1蛋白表達量。用SPSS20.0軟件處理數據，所有數值變異均采用((-x)±S)表示，采用重復數據方差分析、單因素方差分析進行數據處理，P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　結果：
　　1.血清AST、ALT測定
　　K組各時間點血清ALT、AST水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。與K組相比，B組和H組血清AST水平自3h起逐漸升高（P＜0.05

6、）， ALT水平自6小時起逐漸升高（P＜0.05）。與 B組相比，H組血清3h的AST、ALT水平無顯著性差異差（P＞0.05），6h起，H組血清AST、ALT水平顯著低于B組（P＜0.05）。
　　2.肝組織SOD、MDA測定
　　2.1 SOD測定
　　K組各時間點SOD水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。與K組相比，3h、6h的B組、H組SOD值顯著高于K組（P＜0.05），12h、18h、24h的SOD值顯著

7、低于K組。同一時間點相比，H組SOD值顯著高于B組（P＜0.05）。
　　2.2 MDA測定
　　K組各時間點 MDA水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。自首次判定腦死亡后3h起，B組和H組肝組織MDA水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著低于B組（P＜0.05）。
　　3.血清IL-1β、IL-6、TNF-α測定
　　K組各時間點血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平差異無顯著性意義（P＞0.

8、05）。與K組相比，自首次判定腦死亡后3h起，B組和H組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著低于B組（P＜0.05）。
　　4.HE染色肝臟光鏡下變化
　　K組各時間點光鏡下肝細胞形態(tài)結構基本正常，染色較均勻，到24h時細胞無明顯壞死、水腫、空泡化等病理變化。B組于3小時起肝細胞有輕微腫脹，12h起細胞結構較紊亂、胞漿疏松，肝竇受壓變窄且有淤血，胞質疏松淡染且有氣球樣變，匯

9、管區(qū)有中性粒細胞浸潤。H組相同時間點較 B組肝細胞腫脹輕微，細胞結構相對規(guī)整，炎性細胞浸潤較少，微循環(huán)通暢，肝竇淤血較輕。
　　5.透射電鏡觀察
　　K組線粒體結構接近正常，隨著時間增加僅見線粒體脊稍有增厚融合，內質網擴張不明顯。B組自6h起可見部分線粒體脊不清晰，部分粗面內質網有顆粒融合、脫顆?，F象，細胞核結構正常。12h起可見線粒體水腫、空泡化，線粒體嵴部分消失，胞質水腫，核周隙增寬，粗面內質網顆粒融合。24h后可見大部

10、分線粒體嵴和膜融合，核膜不清。H組相應時間點較 B組線粒體結構形態(tài)更完整，脊清晰，且可見有自噬小體，說明細胞自我修復功能完整。
　　6.免疫組織化學檢測
　　6.1 肝組織NF-κB p65檢測
　　K組各時間點NF-κB p65水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。與K組相比，自首次判定腦死亡后6h起，B組和H組肝組織NF-κB p65水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著低于B組（P＜0.05）。

11、r>　　6.2 肝組織Nrf2、HO-1檢測
　　K組各時間點Nrf2、HO-1水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。自首次判定腦死亡后6h起，B組和H組肝組織Nrf2、HO-1水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著高于B組（P＜0.05）。
　　7.Western bolt檢測
　　7.1 肝組織NF-κB p65Western bolt檢測
　　K組各時間點NF-κB p65水平差異無顯著性意義

12、（P＞0.05）。自首次判定腦死亡后6h起，B組和H組肝組織NF-κB p65水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著低于B組（P＜0.05）。
　　7.2 肝組織Nrf2、HO-1 Western bolt檢測
　　K組各時間點Nrf2、HO-1水平差異無顯著性意義（P＞0.05）。自首次判定腦死亡后6h起，B組和H組肝組織Nrf2、HO-1水平逐漸升高（P＜0.05），相同時間點比較H組顯著高于B組（P＜0.

13、05）。
　　結論：
　　1.利用間斷緩慢顱內加壓法可成功建立五指山小型豬腦死亡模型，與臨床腦死亡的發(fā)展過程具有相似性，通過有效的呼吸循環(huán)及血管活性藥物等支持，能使腦死亡模型維持較長時間,可為腦死亡研究提供可靠的動物模型。
　　2.五指山小型豬在腦死亡后肝組織NF-κB表達增加，血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度升高，且抗氧化應激通路蛋白Nrf2/HO-1表達增加，組織 T-SOD水平逐漸降低，氧化應激產