HBV對LPS誘導的NLRP3炎癥小體活化和IL-1β產(chǎn)生的抑制作用及機制研究.pdf

1、研究目的
　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一種嗜肝DNA病毒，全球約有4億HBV攜帶者，HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎，并與肝纖維化、肝硬化和肝癌的發(fā)生密切相關。HBV被認為是一種“隱匿性病毒”，在感染早期能夠逃避機體免疫監(jiān)視，HBV可產(chǎn)生多種病毒相關蛋白以抑制機體天然和適應性抗病毒免疫應答，導致病毒在體內長期存在。
　　NLRP3炎癥小體(inflammasome)是一種存在于胞漿中的

2、大分子多蛋白復合體，能夠感知病原微生物感染、組織損傷和代謝失衡時所釋放的分子信號，促進IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和釋放。NLRP3炎癥小體的活化需要雙信號:第一信號（預刺激信號）由病原相關分子模式(Pathogen-associated molecularpattern，PAMP)誘導產(chǎn)生，通過活化NF-κB信號通路而促進NLRP3和pro-IL-1β的表達;第二信號（活化信號）由危險相關分子模式(Damage-associ

3、ated molecularpatterns，DAMP)誘導產(chǎn)生，通過活化caspase-1促進IL-1β等細胞因子的成熟和分泌。IL-1β作為一種多效炎癥因子，能夠促進多種免疫相關基因的表達，并募集淋巴細胞至感染部位，抑制包括HBV在內的多種病原微生物感染。研究表明，多種病原微生物可通過各種機制抑制NLRP3炎癥小體的活化，進而逃逸機體的免疫應答。但是HBV感染與NLRP3炎癥小體活化之間的關系尚不清楚。
　　肝臟是人體最重要的

4、代謝和解毒器官，來自腸道中的細菌成分（如LPS）可通過門靜脈進入肝臟，導致肝臟中NLRP3炎癥小體的活化和促炎因子的產(chǎn)生，而肝臟又是HBV的主要感染器官，那么HBV能否通過影響肝內NLRP3炎癥小體的活化而促進自身的免疫逃逸？為了探討這一問題，在本研究中，我們首先利用HBV體內外感染模型證實HBV自身并不能活化NLRP3炎癥小體;進而通過給予LPS誘導肝組織中NLRP3炎癥小體的活化，發(fā)現(xiàn)肝臟Kupffer細胞是表達NLRP3炎癥小體和

5、分泌IL-1β的主要細胞，而HBV感染可明顯抑制LPS誘導的NLRP3炎癥小體的活化;繼而利用體外細胞模型、HBeAg突變小鼠模型和臨床HBV慢性感染及肝癌患者標本證實HBV分泌的HBeAg介導了對NLRP3炎癥小體活化的抑制作用，并深入探究了其作用機制;最后，在鼠傷寒感染模型中進一步驗證了HBV對NLRP3炎癥小體活化的抑制作用。
　　研究方法
　　1.通過Real-time PCR和Westem blotting技術檢測

6、HBV穩(wěn)定表達細胞系、HBV感染小鼠及臨床HBV患者肝組織中NLRP3炎癥小體及活化相關分子的表達。
　　2.通過尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2或pAAV/HBV1.2-e-null質粒至C57BL/6小鼠體內，建立HBV感染小鼠模型或HBV-e-null小鼠模型。
　　3.通過ELISA檢測小鼠血清中HBsAg和HBeAg水平;通過免疫組化檢測肝組織原位HBcAg表達;通過熒光定量PCR檢測HBV DNA含量。

7、>　　4.通過流式細胞術和免疫熒光技術檢測Kupffer細胞中IL-1β的表達。
　　5.通過流式細胞術和Westem blotting檢測細胞中NF-κB的活化。
　　6.利用ZDOCK3.0.2程序對HBeAg與TRAM、MAL分子進行模擬對接。
　　7.通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清、血清或肝臟研磨液中IL-1β、IL-18和IL-6的水平。
　　8.通過流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡檢測DCF的熒光強度以檢

8、測ROS產(chǎn)生。
　　9.通過Western blotting檢測細胞膜上p47-phox和Na+/K+ ATPase的表達。
　　10.通過激光共聚焦顯微鏡分別觀察胞漿中Fluo-3/AM和溶酶體中LysoTracker的熒光強度以檢測細胞中Ca2+水平和溶酶體穩(wěn)定性。
　　11.用鼠傷寒沙門氏菌分別感染HBV慢性感染小鼠和對照小鼠后，通過檢測肝臟組織中鼠傷寒沙門氏菌的載量和小鼠生存期，以確定小鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染的

9、敏感性。
　　實驗結果
　　1.HBV感染不能活化NLRP3炎癥小體
　　HepG2.2.15細胞中NLRP3、pro-caspase-1和pro-IL-1β等NLRP3炎癥小體相關分子的表達水平顯著低于HepG2細胞;體外用LPS和不同濃度的HBV顆粒刺激分化后的THP-1細胞不能活化NLRP3炎癥小體;與對照小鼠相比，急性和慢性HBV感染小鼠的肝組織中NLRP3炎癥小體相關成分及血清中IL-1β表達均未見明顯升高。

10、
　　2.HBV能夠抑制LPS誘導的NLRP3炎癥小體的活化
　　HBV慢性感染可顯著抑制LPS誘導的小鼠肝組織中NLRP3和pro-IL-1β的表達、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;肝臟中的巨噬細胞是表達NLRP3炎癥小體和分泌IL-1β的主要細胞，并且HBV主要抑制小鼠肝臟Kupffer細胞中IL-1β的表達;用含HBV成分的培養(yǎng)上清孵育分化的THP-1細胞能夠顯著抑制細胞中LPS誘導的NLRP3和pro-

11、IL-1β的表達、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌。以上結果說明，HBV對LPS誘導的NLRP3炎癥小體的活化有抑制作用。
　　3.HBeAg，而非HBsAg，具有抑制NLRP3炎癥小體活化的作用
　　HBeAg預孵育可顯著抑制LPS誘導的THP-1細胞中的NLRP3和pro-IL-1β的表達、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;體內實驗顯示，HBV慢性感染可顯著抑制LPS誘導的NLRP3炎癥小體活化，

12、但是在HBeAg缺失的HBV慢性感染小鼠中，HBV對炎癥小體的抑制作用減弱;HBeAg不但可以抑制LPS誘導的NLRP3炎癥小體的活化，還能抑制其它活化劑誘導的該炎癥小體的活化。HBsAg預孵育與否并不影響LPS誘導的THP-1細胞中NLRP3炎癥小體的活化。以上結果說明，對NLRP3炎癥小體發(fā)揮抑制作用的是HBeAg，而不是HBsAg。
　　4.HBeAg通過抑制NF-κB的活化抑制NLRP3和pro-IL-1β的表達
　

13、　HBeAg預孵育分化的THP-1細胞，可顯著抑制LPS誘導的NF-κB的活化水平和下游細胞因子IL-6和TNF-α的表達。利用ZDOCK3.0.2程序對HBeAg和NF-κB信號通路下游的兩個接頭分子TRAM和MAL進行模擬對接，發(fā)現(xiàn)HBeAg和這兩個分子均存在結合區(qū)域。說明HBeAg有可能通過與TRAM和MAL分子結合而抑制NF-κB的活化。
　　5.HBeAg通過抑制ROS產(chǎn)生抑制NLRP3炎癥小體的活化
　　HBeA

14、g預孵育分化的THP-1細胞，可顯著抑制LPS誘導的NADPH氧化酶的活化，進而抑制ROS的產(chǎn)生;外加H2O2后，HBeAg對NLRP3炎癥小體的抑制作用明顯降低。
　　6.HBeAg+的臨床HCC和CHB患者體內NLRP3炎癥小體的活化被抑制
　　HBeAg+的HCC患者癌旁組織NLRP3、活化的caspase-1 p20、pro-IL-1β和成熟的IL-1β p17的表達水平顯著低于HBeAg-患者。同樣，HBeAg+的

15、HCC患者肝組織Kupffer細胞中IL-1β水平明顯低于HBeAg-患者。
　　免疫耐受期(HBeAg+) CHB患者血清IL-1β水平較低，而部分免疫非活化期(HBeAg)患者血清IL-1β水平較高。除HBeAg外尚有其它因素對炎癥小體的活化和IL-1β的表達產(chǎn)生影響。
　　7.HBV慢性感染小鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染更加敏感
　　與對照小鼠相比，HBV慢性感染小鼠在感染鼠傷寒沙門氏菌后，體內NLRP3和pro-IL

16、-1β的表達、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌更低，肝組織的細菌載量更高，生存期更短。說明HBV可能通過降低NLRP3炎癥小體的活化和IL-1β的表達增加小鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染的敏感性。
　　結論及意義
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)Kupffer細胞是肝臟中表達NLRP3炎癥小體和產(chǎn)生IL-1β的主要細胞。
　　2.本研究首次發(fā)現(xiàn)HBV本身不能活化NLRP3炎癥小體，但可以通過HBeAg抑制LPS誘導的NLRP3炎

17、癥小體的活化和IL-1β等促炎因子的產(chǎn)生，從而抑制機體的抗病毒免疫應答，有利于HBV在體內的存活和慢性感染狀態(tài)的形成。
　　3.本研究首次闡明HBeAg抑制NLRP3炎癥小體的兩個途徑:既通過抑制NF-κB信號通路抑制NLRP3和pro-IL-1β分子的表達，又通過抑制ROS抑制caspase-1的活化和IL-1β的成熟。
　　4.本研究首次發(fā)現(xiàn)HBV可通過抑制肝臟NLRP3炎癥小體活化而抑制炎癥反應并闡明了其主要分子機制，