白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)HEK293T細(xì)胞自噬與凋亡關(guān)系的初步研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室的研究已經(jīng)證明低濃度的鎘（＜10μM）可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，而在高濃度鎘刺激下細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)、透射電子顯微鏡、Western blot、倒置相差顯微鏡、激光共聚焦、流式細(xì)胞術(shù)等細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，以HEK293T細(xì)胞為研究對(duì)象，研究分析了白藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞自噬之間的關(guān)系;以鎘誘導(dǎo)的自噬為前提，探究白藜蘆醇與自噬體-溶酶體融合之間的關(guān)系;分析了白藜蘆醇(RSV)的抗氧化性與鎘誘導(dǎo)的自噬間的關(guān)系;探究白

2、藜蘆醇與鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴HEK293T細(xì)胞懸液(5×105)接種于6孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分成對(duì)照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組：細(xì)胞暴露于40μM鎘中24h；細(xì)胞用白藜蘆醇(40μM)預(yù)處理1小時(shí)后暴露于（0～10μM）鎘中24h；選用40μM白藜蘆醇和5 mM3-MA聯(lián)合8和10μM鎘處理HEK293T細(xì)胞24 h。本試驗(yàn)采用透射電子顯微鏡觀察自噬體與自噬溶酶體;Western blotting分析自噬標(biāo)

3、志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量的變化;激光共聚焦顯微鏡分析GFP-LC3的點(diǎn)狀聚集。結(jié)果顯示，HEK293T細(xì)胞暴露在鎘后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)目明顯增多。白藜蘆醇能加強(qiáng)鎘誘導(dǎo)的自噬，且在8和10μM時(shí)變化明顯，加入自噬抑制劑3-MA后這種現(xiàn)象被抑制。提示:鎘能誘導(dǎo)自噬，而白藜蘆醇能夠協(xié)同鎘引起細(xì)胞自噬。⑵HEK293T細(xì)胞懸液(5×105)接種于6孔板中，選用40μM RSV和/或5 mM3-MA分別聯(lián)合8和10μM Cd處理KEK293

4、T細(xì)胞24 h;選用40μM RSV和/或3μMTG分別聯(lián)合8和10μM Cd處理KEK293T細(xì)胞24 h。利用Westernblotting分析溶酶體標(biāo)志蛋白cathepsin L、自噬標(biāo)志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量;用激光共聚焦觀察GFP-LC3和LAMP2的共定位。結(jié)果顯示，在鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬中，白藜蘆醇能增強(qiáng)溶酶體的活性，而當(dāng)自噬被抑制時(shí)溶酶體的活性也降低;加入自噬體溶酶體融合抑制劑TG以后，雖然增加了細(xì)胞的自噬能力，卻降低

5、了溶酶體的活性，而白藜蘆醇未能改變這種結(jié)果。⑶HEK293T細(xì)胞懸液(5×105)接種于6孔板中。試驗(yàn)組:細(xì)胞用白藜蘆醇(40μM)預(yù)處理1小時(shí)后暴露于（0～10μM）鎘中24 h;用40μM RSV和/或1μMEX-527分別聯(lián)合10μM鎘處理KEK293T細(xì)胞24 h;用40μM RSV和/或1μM EX-527分別聯(lián)合1 mM H2O2處理KEK293T細(xì)胞24h。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)活性氧ROS的表達(dá)量;Western blottin

6、g分析SIRT1蛋白、自噬標(biāo)志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量;用激光共聚焦GFP-LC3和LAMP2的共定位。結(jié)果顯示，隨著鎘濃度的增加ROS也增加，而加入白藜蘆醇后ROS降低;白藜蘆醇能激活SIRT1，而當(dāng)SIRT1的表達(dá)量被抑制時(shí)，白藜蘆醇對(duì)自噬的促進(jìn)作用也減弱。提示:白藜蘆醇增強(qiáng)鎘誘導(dǎo)的自噬可能都與其抗氧化性有關(guān)，而其中SIRT1起著重要的作用。⑷HEK293T細(xì)胞懸液(5×105)接種于6孔板中，適應(yīng)性培養(yǎng)后，用40μMRSV、1

7、0μM Cd、20μM Cd、10μMCd+ RSV和20μM Cd+ RSV分別處理HEK293T細(xì)胞。相應(yīng)時(shí)間后用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);Western blotting分析caspase-3的表達(dá)量;用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡數(shù)量。結(jié)果顯示，HEK293T細(xì)胞暴露于鎘24 h后，細(xì)胞皺縮變形甚至死亡，而加入白藜蘆醇后，細(xì)胞形態(tài)改變被抑制;鎘誘導(dǎo)了caspase-3表達(dá)量增加，而加入白藜蘆醇后被降低;鎘誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可以被白藜蘆醇阻