白藜蘆醇抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、白藜蘆醇是一種植物抗毒素，多存在于葡萄或葡萄制品，例如紅酒中。最近多項(xiàng)研究表明，白藜蘆醇除了具有延緩衰老、降低氧化壓力、防治心血管疾病等作用外，對多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程也具有抑制作用。SIRT1為細(xì)胞內(nèi)組蛋白/非組蛋白去乙?；福前邹继J醇重要的下游靶分子。在胃癌細(xì)胞中，敲低SIRT1去除了白藜蘆醇對胃癌細(xì)胞的抑制作用。Nathan等人通過對SIRT1缺陷小鼠和SIRT1過表達(dá)小鼠異體移植腫瘤模型的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1是白藜蘆醇抑制癌細(xì)

2、胞增殖所必須的。在霍奇金淋巴瘤中，白藜蘆醇通過降低SIRT1表達(dá)水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Pacholec等人在體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇不是SIRT1的直接激活劑。因此，SIRT1在白藜蘆醇抑制癌細(xì)胞增殖中的作用還需要進(jìn)一步探究。SIRT1作為一種去乙?；?，可以通過調(diào)節(jié)多種下游靶蛋白如p53、FoxOs、NF-κB的活性在細(xì)胞生長分化中起到關(guān)鍵的作用。抑癌基因p53監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)基因的完整性，當(dāng)細(xì)胞受損嚴(yán)重時會引發(fā)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡途徑，誘

3、導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SIRT1可以通過去乙?；痯53調(diào)節(jié)其活性。在胃癌、乳腺癌等癌細(xì)胞中，白藜蘆醇通過上調(diào)p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxOs)也是一個抑癌基因。白藜蘆醇通過去乙酰化和去磷酸化等翻譯后修飾途徑調(diào)節(jié)其活性。在原位胰腺癌中，白藜蘆醇通過抑制PI3K/AKT和MEK/ERK途徑使FoxOs去磷酸化并發(fā)生核募集，激活FoxOs，進(jìn)而活化FoxOs下游靶蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Vogt等人研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可以與FoxOs直接作用，通過

4、去乙酰化特定位點(diǎn)調(diào)節(jié)FoxOs的活性?；罨腇oxOs可以直接激活凋亡起始基因Bim的表達(dá)從而促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。雖然白藜蘆醇通過SIRT1、FoxOs、p53通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究多有報(bào)道，但在肝癌細(xì)胞中白藜蘆醇是否通過SIRT1、FoxOs、p53及其相關(guān)信號通路抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡還不清楚，需要進(jìn)一步深入探究。
　　我們利用三種肝癌細(xì)胞系和一種正常肝細(xì)胞系，研究白藜蘆醇抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：白藜

5、蘆醇能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。MTT檢測這四種細(xì)胞系，所得白藜蘆醇的半抑制濃度分別為：IC50（HepG2）=109μΜ、IC50（SSMC-7721）=105μΜ、IC50（Bel-7402）=128μΜ、IC50（HL-7702）=162μΜ。與正常肝細(xì)胞HL-7702相比，白藜蘆醇對肝癌細(xì)胞系HepG2、SSMC-7721、Bel-7402的抑制作用更顯著。為了研究白藜蘆醇是否以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制細(xì)胞增

6、殖，我們使用Hoechst/PI染色檢測白藜蘆醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生凋亡的情況。發(fā)現(xiàn)100μΜ以上濃度的白藜蘆醇顯著上調(diào)了凋亡細(xì)胞比率，且呈現(xiàn)劑量依賴性。應(yīng)用Western Blot方法檢測白藜蘆醇處理后細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果顯示白藜蘆醇通過激活p53和Bim兩個凋亡起始因子的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。SIRT1、FoxO1和FoxO3是白藜蘆醇的重要靶分子，并且能夠調(diào)控p53和Bim兩個凋亡相關(guān)蛋白。因此，我們進(jìn)一步檢測

7、白藜蘆醇處理后SIRT1和FoxOs的變化，探究白藜蘆醇是否通過SIRT1或FoxOs誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，100μΜ白藜蘆醇對細(xì)胞內(nèi)SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)無顯著性影響。由于SIRT1會發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象，我們通過熒光顯微術(shù)檢測白藜蘆醇是否通過誘導(dǎo)SIRT1核轉(zhuǎn)運(yùn)改變細(xì)胞亞定位，發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。結(jié)果顯示：白藜蘆醇沒有改變SIRT1在細(xì)胞內(nèi)的亞定位，但白藜蘆醇顯著上調(diào)了FoxO3、Fox