PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元IRE1α-ASK1通路應(yīng)答未折疊蛋白反應(yīng)的分子機(jī)制.pdf

1、目的:創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder, PTSD)是因?yàn)橥话l(fā)性的事件或處境而導(dǎo)致的延遲性的精神障礙，病人因?yàn)橥话l(fā)性的災(zāi)難事件，或者面臨極度令人害怕的場(chǎng)景，出現(xiàn)悲傷、恐懼，導(dǎo)致個(gè)人延遲出現(xiàn)精神障礙，而且這種精神障礙會(huì)長(zhǎng)期持續(xù)存在。
　　PTSD最顯著的特征有:再體驗(yàn)（重復(fù)而且持續(xù)體驗(yàn)創(chuàng)傷性的事件）;事件回避（逃避回憶及反應(yīng)麻木）;高喚起（警覺(jué)性增高）[1]。
　　目前研究發(fā)現(xiàn)PTSD

2、的發(fā)病機(jī)理有三個(gè)方面:皮質(zhì)類(lèi)醇激素受體功能下降，去甲腎上腺素能和加壓素能系統(tǒng)的興奮，5-HT系統(tǒng)的缺陷[2]。
　　5-HT陽(yáng)性細(xì)胞廣泛分布于中縫核各部，尤以中縫背核部位密集，在情緒調(diào)節(jié)和焦慮行為的病理生理機(jī)制中發(fā)揮的重要作用[3]。在PTSD前期研究中，F(xiàn)eifei Luo等發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元5-HT1A受體的表達(dá)增高[4]; Dongjuan Liu等從PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元凋亡-線(xiàn)粒體路徑和溶酶體路徑進(jìn)行了研

3、究，發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C的釋放增多， TMP（三偏磷酸酶）活性增強(qiáng)，而且中縫背核神經(jīng)元存在凋亡的形態(tài)學(xué)改變[5]。由此可見(jiàn)，中縫背核神經(jīng)元的凋亡可能在PTSD的發(fā)病中起重要作用，這可能是大鼠創(chuàng)傷后異常情緒和行為形成的重要病理學(xué)基礎(chǔ)之一。
　　據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是一條新的細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路[6～8]，許多疾病的發(fā)病機(jī)

4、制都與過(guò)度ERS引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)[9～11]。
　　當(dāng)ERS發(fā)生在細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)應(yīng)對(duì)ERS。參加未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白主要有3個(gè):PRKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)激酶(PRKR-like endoplasmic reticulumkinase，PERK)、活化轉(zhuǎn)錄因子6α（activating

5、 transcription factor6，ATF6α）和肌醇需酶1α（inositol requiring kinase1α，IRE1α）[12]。
　　ERS初期細(xì)胞主要通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白誘發(fā)的三個(gè)信號(hào)通路: PERK通路、IRE1α通路和ATF6通路來(lái)重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能[13]。
　　但如果發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，持續(xù)的應(yīng)激超出了細(xì)胞進(jìn)行UPR的能力，細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)無(wú)法恢復(fù)到正常狀態(tài)的時(shí)候， ER

6、S就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。三個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白在過(guò)度ERS時(shí)誘發(fā)的三個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的最終通路主要包括CHOP通路和IRE1α-ASK1-JNK通路。
　　在ERS早期，PERK介導(dǎo)的信號(hào)通路最先被激活，PERK的激活可迅速減少細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)負(fù)荷。如ERS仍然持續(xù)，細(xì)胞將進(jìn)一步激活A(yù)TF6α途徑，ATF6α信號(hào)通路應(yīng)答UPR可激活XBP1及上調(diào)蛋白質(zhì)折疊相關(guān)酶、分子伴侶，以增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的處理能力

7、，同時(shí)為IRE1激活做好物質(zhì)準(zhǔn)備。在PTSD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ATF6α途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡方面，Juhua Xie等發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠中縫背核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白ATF6α、分子伴侶GRP94的表達(dá)均明顯升高，提示PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元啟動(dòng)了UPR，激活了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白ATF6α通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步從ERS這個(gè)角度研究PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元凋亡提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[14，15]。
　　而若ERS繼續(xù)存在，細(xì)胞將啟動(dòng)IRE1α介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)

8、網(wǎng)應(yīng)激徑路凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[16]。被激活的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1α可誘導(dǎo)并活化XBP1蛋白的表達(dá)[17]。被激活的XBP1蛋白可以激活下游的ERS蛋白，其中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶BIP和CHOP(C/EBP homologous protein)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解相關(guān)基因的表達(dá)增高，從而激活了UPR和ERS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡徑路[18]。
　　PTSD是應(yīng)激性精神障礙，通常是在遭受到各種巨大災(zāi)難后而發(fā)病，而這些災(zāi)難刺激均屬于超強(qiáng)刺激，可導(dǎo)

9、致過(guò)度ERS，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的修飾加工能力大大降低，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚，從而啟動(dòng)了未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR)。
　　那么PTSD大鼠是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)信號(hào)通路呢？LiX等報(bào)告PTSD大鼠前額內(nèi)側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)元的IRE1α和XBP1在蛋白和基因水平均表達(dá)增高，說(shuō)明PTSD大鼠發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-XBP1通路誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋

10、亡[19]。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，IRE1α的活化一方面能誘導(dǎo)XBP1、CHOP的表達(dá)，另一方面，IRE1α還可以結(jié)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF-receptor associated factor2，TRAF2)，形成IRE1α與TRAF2復(fù)合體來(lái)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(apoptosissignal-regulating kinase1，ASK1)[20]。活化的ASK1能夠通過(guò)激活其下游的信號(hào)分子JNK和p38，經(jīng)

11、過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)傳遞信號(hào)，促使細(xì)胞凋亡[21]。
　　目前，在PTSD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-ASK1信號(hào)通路引起神經(jīng)元凋亡方面，尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究將研究目標(biāo)集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-ASK1通路應(yīng)答UPR，誘發(fā)中縫背核神經(jīng)元凋亡的信號(hào)通路上，從蛋白和基因水平上觀(guān)察PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元IRE1α、ASK1及其下游信號(hào)分子JNK、P38、CHOP、Bcl-2、Bax表達(dá)量變化，從中找出預(yù)防和有效治療PTSD的藥

12、物新靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　采用國(guó)際上公認(rèn)的的單一延長(zhǎng)應(yīng)激(single-prolonged stress，SPS)的方法建立PTSD大鼠模型[22]，隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、SPS刺激后1天組、SPS刺激后4天組、SPS刺激后7天組和SPS刺激后14天組;
　　采用Monies水迷宮測(cè)試SPS刺激后大鼠的空間記憶和學(xué)習(xí)能力的表現(xiàn)，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。
　　采用免疫組化、Western b

13、lotting及RT-PCR檢測(cè)正常對(duì)照組和模型組大鼠IRE1α、ASK1和JNK蛋白表達(dá)及mRNA分子水平表達(dá);
　　采用免疫組化、Western blotting及RT-PCR檢測(cè)正常對(duì)照組和模型組大鼠P38、CHOP蛋白表達(dá)及mRNA分子水平表達(dá);
　　采用Western blotting及RT-PCR檢測(cè)正常對(duì)照組和模型組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及mRNA分子水平表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、PTSD

14、大鼠行為學(xué)改變
　　Morries水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠平均逃避潛伏期顯著高于正常對(duì)照組，同時(shí)空間探索實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠在目標(biāo)象限停留的時(shí)間百分比明顯低于正常對(duì)照組。
　　2、PTSD中縫背核神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-ASK1-JNK通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究
　　2.1免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)IRE1α表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:IRE1α的陽(yáng)性表達(dá)主要分布于中縫背核神經(jīng)元核周質(zhì)，陽(yáng)性信

15、號(hào)呈棕黃色顆粒。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，經(jīng)SPS刺激后第1d，與正常對(duì)照組比較，IRE1α陽(yáng)性表達(dá)稍有增多，第4d和7d表達(dá)量最高(P＜0.01)，隨后第14天表達(dá)量顯著下降(P＜0.01);第4d和7d表達(dá)量差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.2 Western blotting檢測(cè)IRE1α、ASK1和JNK蛋白表達(dá)
　　在SPS刺激后，IRE1α的蛋白表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，明顯升高，于7天達(dá)到峰值，隨后下降;AS

16、K1、JNK的蛋白表達(dá)量，與正常對(duì)照組比較，明顯升高，于4天達(dá)到峰值，隨后下降。
　　2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果IRE1α、ASK1和JNK的mRNA表達(dá)
　　在SPS刺激后，IRE1α的mRNA表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，明顯升高，于7天達(dá)到峰值，隨后下降;ASK1、JNK的mRNA表達(dá)量，與正常對(duì)照組比較，明顯升高，于4天達(dá)到峰值，隨后下降。
　　3、PTSD中縫背核神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-ASK1-P38通路誘

17、導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究
　　3.1 Western blotting檢測(cè)P38、CHOP蛋白表達(dá)
　　P38的蛋白表達(dá)量，與正常對(duì)照組比較，也明顯升高，于1天達(dá)到峰值，隨后下降;CHOP的蛋白表達(dá)量，與正常對(duì)照組比較，明顯升高，于4天達(dá)到峰值，隨后下降。
　　3.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果P38、CHOP的mRNA表達(dá)
　　在SPS刺激后，P38的mRNA表達(dá)量，與正常對(duì)照組比較，明顯升高，于4天達(dá)到峰值，隨后下

18、降;CHOP的mRNA表達(dá)，與正常對(duì)照組比較，明顯升高，于第7天達(dá)到峰值，隨后下降。
　　4、Bcl-2、Bax因子與PTSD中縫背核神經(jīng)元凋亡的相關(guān)性研究
　　4.1 Western blotting檢測(cè)Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)
　　Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)量，與正常對(duì)照組比較，也呈現(xiàn)出先升高再下降的趨勢(shì)，但是Bcl-2蛋白表達(dá)峰值出現(xiàn)較早，在SPS1天即達(dá)到，隨后表達(dá)量下降，維持在穩(wěn)定水平，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)

19、量，與正常對(duì)照組比較，在SPS刺激的早期（1-3天），無(wú)明顯變化，于SPS刺激4天后明顯升高，維持在較高水平。
　　4.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá)
　　Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)量，與正常對(duì)照組比較，也呈現(xiàn)出先升高再下降的趨勢(shì)，但是Bcl-2 mRNA表達(dá)峰值出現(xiàn)較早，在SPS1天即達(dá)到，隨后表達(dá)量下降，維持在穩(wěn)定水平，而B(niǎo)ax的mRNA表達(dá)量，與正常對(duì)照組比較，在SPS刺激的早期（1-3

20、天），無(wú)明顯變化，于SPS刺激7天后明顯升高，維持在較高水平。
　　結(jié)論:
　　1、經(jīng)SPS刺激后，PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元的IRE1α-ASK1-JNK細(xì)胞凋亡信號(hào)通路被明顯激活，誘發(fā)了下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致了中縫背核神經(jīng)元的凋亡。
　　2、經(jīng)SPS刺激后，PTSD大鼠中縫背核神經(jīng)元的IRE1α-ASK1-P38細(xì)胞凋亡信號(hào)通路被明顯激活，誘發(fā)了下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致了中縫背核神經(jīng)元的凋亡。
　　3、在SPS刺激