阻斷Kupffer細(xì)胞中IRE1-XBP1通路誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受形成的機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　肝臟移植是目前治療終末期肝臟疾病最有效的治療選擇。但移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生造成的移植物失功仍未得到理想的解決。受困于供體肝來(lái)源緊缺的國(guó)際大環(huán)境，更使得如何誘導(dǎo)移植術(shù)后移植肝特異性免疫耐受一直是移植領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)及重點(diǎn)。我們的團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn),Kupffer細(xì)胞（KCs）作為體內(nèi)具有高效抗原呈遞功能的巨噬細(xì)胞群，在術(shù)后誘導(dǎo)移植肝臟免疫耐受中起著雙重效應(yīng)，但其確切機(jī)制目前尚不清楚?？赡芘c誘導(dǎo)Th亞群細(xì)胞間動(dòng)態(tài)平衡以及自身

2、極化有關(guān)。新近發(fā)現(xiàn)肌醇酶1-X盒連接蛋白1（Inositol Requiring1-X Box Binding Protein1,IRE1-XBP1）通路不僅參與了非折疊蛋白反應(yīng)（Unfold Protein Response,UPR），還對(duì)抗原呈遞細(xì)胞（Antigen Presenting Cells, APCs）的功能具有調(diào)節(jié)作用，但并未涉及肝移植領(lǐng)域。因此探索KCs中IR E1-XBP1通路活性在移植肝免疫反應(yīng)中的作用與機(jī)制，可能

3、為臨床實(shí)踐提供新的靶點(diǎn)以及理論依據(jù)。
　　第一部分.IRE1-XBP1對(duì)Kupffer細(xì)胞功能的調(diào)控及對(duì)初始T淋巴細(xì)胞功能和分化的影響
　　目的:分離、培養(yǎng) LEWIS大鼠肝臟KCs，通過(guò)抑制或上調(diào)KCs中IR E1-XBP1活性，觀察這一通路對(duì)KCs功能的調(diào)控及其對(duì)初始T淋巴細(xì)胞功能及分化的作用機(jī)制。
　　方法:
　?、俨扇V型膠原酶消化肝臟聯(lián)合非連續(xù)梯度離心法分離Lewis大鼠KCs；
　?、诿庖呓M化

4、、激光共聚焦分別檢測(cè)KCs表面CD68和CD163的表達(dá)來(lái)鑒定KCs；
　　③吞墨以及吞熒光乳膠顆粒實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷KCs的吞噬能力；臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定KCs的活性。鑒定后的KCs隨機(jī)分為四組：XBP1抑制組（XBP1-shRNA group）；錯(cuò)義序列沉默對(duì)照組（Scrambled-shRNA group，Ctrl-shRNA）；XBP1過(guò)表達(dá)組（AdV-XBP1 group）；錯(cuò)義序列過(guò)表達(dá)對(duì)照組(AdV-Scrambled group

5、，Ctrl-AdV)；
　?、軣晒怙@微鏡下以及激光共聚焦檢測(cè)法評(píng)估質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率；
　?、軷T-PCR以及Western Blot檢測(cè)各組KCs中XBP1、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17、JAK1、JAK2、STAT1以及STAT3的基因及蛋白表達(dá)水平；
　　⑥流式細(xì)胞術(shù)（FCM）以及激光共聚焦檢測(cè)各組 KCs表型的變化情況；
　?、逧LISA檢測(cè)KCs自分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1

6、7的水平；
　　⑧分離大鼠脾臟淋巴細(xì)胞，尼龍毛柱過(guò)濾純化T細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)純度，與上述各組KCs共培養(yǎng)，MTT法及Brdu滲入法檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況；
　?、?Annexin V/PI法FCM觀察T淋巴細(xì)胞凋亡情況；⑩ELISA測(cè)定上清液中IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17及IL-10含量。
　　結(jié)果:
　?、貹Cs細(xì)胞表面CD68和CD163呈強(qiáng)陽(yáng)性及強(qiáng)熒光強(qiáng)度表達(dá)，提示我們提取的是大鼠的KCs。吞噬實(shí)

7、驗(yàn)以及臺(tái)盼藍(lán)染色提示分離培養(yǎng)的KC s具有良好的吞噬能力及活性；
　?、谵D(zhuǎn)染XBP1的沉默質(zhì)粒以及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，6h開(kāi)始零星出現(xiàn)熒光表達(dá)，48小時(shí)前后達(dá)到高峰，2w后開(kāi)始逐漸下降；RT-PCR以及WB結(jié)果顯示，XBP1沉默組中XBP1的表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低，而在XBP1過(guò)表達(dá)組則明顯上調(diào)；
　?、跢CM以及激光共聚焦術(shù)發(fā)現(xiàn)，XBP1沉默組中MHC-II、CD86、CD40的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，而CD204和CD206的表達(dá)

8、則顯著高于對(duì)照組；而在XBP1過(guò)表達(dá)組，則呈相反趨勢(shì)；
　?、躓B檢測(cè)發(fā)現(xiàn)XBP1沉默組中JAK1、JAK2、STAT1和STAT3的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平均受到抑制，而在XBP1過(guò)表達(dá)組則上述蛋白的表達(dá)及磷酸化水平得到顯著增強(qiáng)；
　?、軫CM檢測(cè)T細(xì)胞純度為78.73±4.35％，其中CD4+為58.84±10.47%，CD4+/CD8+T細(xì)胞比例為2.95。和各組KCs共培養(yǎng)3d后，發(fā)現(xiàn)抑制KCs中IR E1-XBP1活

9、性后T細(xì)胞增殖受到明顯抑制，凋亡增加，促炎細(xì)胞因子分泌減少，抗炎細(xì)胞因子分泌增加（P<0.05），而上調(diào)KCs中IR E1-XBP1活性后T細(xì)胞增殖則明顯增強(qiáng)，凋亡明顯減少，促炎細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α）分泌增加，抗炎細(xì)胞因子（IL-10）分泌減少（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　?、貹Cs中IRE1-XBP1通路活性變化可以轉(zhuǎn)化 KCs的極性狀態(tài)，并通過(guò)調(diào)節(jié)JAK-S TAT家族成員表達(dá)，調(diào)控KCs自分泌細(xì)胞因子的

10、組成成分；
　?、贙Cs中IR E1-XBP1通路活性變化可以影響共培養(yǎng)初始T淋巴細(xì)胞的增殖分化、凋亡以及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。
　　第二部分.大鼠原位肝移植急性排斥模型建立和攜XBP1-shRNA質(zhì)粒的脂質(zhì)包裹液態(tài)氟碳納米粒靶向轉(zhuǎn)染Kupffer細(xì)胞的效果評(píng)估
　　目的:建立LEWIS-BN大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型，用攜帶XBP1-shRNA的脂質(zhì)包裹氟碳納米粒（perfluorocarbonnanopartic

11、les，PFCN）與XBP1-shRNA慢病毒分別轉(zhuǎn)染上述急性排斥反應(yīng)模型，評(píng)價(jià)兩種不同轉(zhuǎn)染載體對(duì)KCs靶向性干擾的高低。
　　方法:采用改良Kamada"雙套管"法建立LEWIS-BN大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型；采用兩步乳化法制作脂質(zhì)包裹的PFCN乳液，通過(guò)正負(fù)電荷連接X(jué)BP1-shRNA質(zhì)粒。
　?、賆BP1-shRNA-PFCNP組：經(jīng)門(mén)靜脈注射XBP1-shRNA-PFCNP(1ml/1000g),1x109Tu

12、/mL，再推注2mL生理鹽水;
　?、赬BP1-shRNA-Lentivirus組：經(jīng)門(mén)靜脈注射XBP1-shRNA-Lentivirus2mL，1x109Tu/mL；
　?、蹖?duì)照組：經(jīng)門(mén)靜脈推注生理鹽水2mL。觀察轉(zhuǎn)染后3天及7天KCs、肝細(xì)胞、脾臟及小腸中XBP1的表達(dá)改變。
　　結(jié)果:
　?、貾FH以1：8的比例、聲震時(shí)間80s得到性質(zhì)穩(wěn)定的平均粒徑為283.78±23.16的PFCN；成功建立穩(wěn)定的LEW

13、IS-BN大鼠原位肝移植模型；
　　②RT-PCR與WB結(jié)果提示：術(shù)后第3d，PFCN組及慢病毒組均能有效抑制KCs中XBP1的表達(dá)，抑制效率未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；同時(shí)兩種方式對(duì)肝細(xì)胞及小腸內(nèi)XBP1也有抑制作用，但慢病毒組抑制程度明顯高于PFCN組；
　　③術(shù)后7d，慢病毒組對(duì)KCs中XBP1的抑制程度明顯弱于PFCN組，而對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)XBP1的抑制作用則明顯強(qiáng)于PFCN組；PFCN組對(duì)脾和小腸的影響與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而慢病毒

14、組則持續(xù)抑制，但抑制率較3d時(shí)減弱。
　　結(jié)論:LEWIS-BN是一種穩(wěn)定的大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型；采用改良"雙套管"法能穩(wěn)定高效的構(gòu)建這一模型；攜帶XBP1-shRNA的PFCN作為轉(zhuǎn)染載體，較慢病毒經(jīng)由門(mén)靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染，具有更高的KCs靶向性以及抑制效率。
　　第三部分.阻斷Kupffer細(xì)胞中IRE1-XBP1通路活性誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察阻斷移植肝KCs中IR E1-XBP1通路

15、活性對(duì)大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型的作用及機(jī)制。
　　方法:
　?、俨扇「牧肌癒amada”雙套管法建立LEWIS-BN大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型；
　　②受體隨機(jī)分為三組：生理鹽水組（NS），錯(cuò)義序列沉默對(duì)照組（Scrambled-shRNA group，Ctrl-shRNA）和沉默組（XBP1-shRNA），劑量參考第二部分。
　　③觀察術(shù)后7天各組受體生存時(shí)間與肝功能變化；移植肝病理改變；
　?、躎UN

16、EL檢測(cè)移植區(qū)細(xì)胞凋亡情況；
　?、軷eal-time PCR檢測(cè)肝組織中T-bet、RORγt、IFN-γ、IL-17及IL-10 mRNA表達(dá)水平；Western Blot檢測(cè)移植肝中CD40、CD86、CD204、CD206、IFN-γ、IL-17及IL-10蛋白表達(dá)水平；
　?、轊LISA檢測(cè)外周血中IFN-γ、IL-17和IL-10的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　?、傩g(shù)后第7天，沉默組受體存活時(shí)間以及肝功能

17、較其余兩組得到明顯的改善（P<0.05）；RAI評(píng)分屬輕度排斥反應(yīng)，其余兩組呈重度排斥反應(yīng)。TUN EL顯示沉默組匯管區(qū)淋巴細(xì)胞凋亡程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組以及生理鹽水組。
　?、诔聊M中T-bet、RORγt、IFN-γ、IL-17的mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組以及生理鹽水組（P<0.05）。而IL-10的含量則高于其余兩組（P<0.05）。
　?、鄢聊M中CD40、CD86、IFN-γ、IL-17的蛋白表達(dá)明顯減弱，而C

18、D204、CD206和IL-10的蛋白水平則較其余兩組明顯上調(diào)（P<0.05）。
　?、蹺LISA結(jié)果提示隨著移植后時(shí)間的推移，沉默組外周血清中IFN-γ、IL-17的表達(dá)量與對(duì)照組以及生理鹽水組比較，逐漸降低（P<0.05）；而IL-10的表達(dá)則逐漸增加（P<0.05）。
　　結(jié)論:體內(nèi)阻斷KCs中IRE1-XBP1通路能顯著減輕AcR對(duì)肝臟組織的破壞程度并誘導(dǎo)免疫耐受形成；其機(jī)制可能與誘導(dǎo)活化M1樣KCs向M2樣KCs轉(zhuǎn)