ANXA5表達(dá)調(diào)控人肝癌HepG2細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及順鉑耐藥性的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:膜聯(lián)蛋白A5(Annexin A5，ANXA5)，在多種組織中普遍表達(dá)。ANXA5異常表達(dá)與多種惡性腫瘤相關(guān);與原位肝癌組織相比，ANXA5在肝門靜脈瘤栓中高表達(dá);在順鉑耐受的鼻咽癌細(xì)胞中也呈高表達(dá)。本課題組前期研究表明，ANXA5表達(dá)水平影響小鼠肝癌細(xì)胞(Hca-F/Hca-P)的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)功能，具有促進(jìn)作用。本論文研究ANXA5影響人HepG2生物學(xué)行為及機(jī)制研究。
　　目的:1、構(gòu)建pGPU6/GFP/N

2、eo-shRNA-ANXA5表達(dá)載體，利用脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至HepG2中，篩選ANXA5表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)單克隆細(xì)胞株及對照細(xì)胞株;2、研究ANXA5對HepG2體外增殖、遷移、侵襲、粘附、細(xì)胞骨架形成的影響及作用的分子機(jī)制;3、探究ANXA5對HepG2細(xì)胞cisplatin耐受性的影響。
　　方法:1、根據(jù)人源ANXA5的mRNA序列，設(shè)計特異性siRNA及無關(guān)序列，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA5/NC表達(dá)載體

3、;2、利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至HepG2中，G418篩選及Western Blot驗(yàn)證獲得ANXA5表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)單克隆細(xì)胞株及對照細(xì)胞株;3、MTT法聯(lián)合平板克隆形成實(shí)驗(yàn)探究ANXA5對HepG2體外增殖能力影響;4、Transwell小室法結(jié)合劃痕實(shí)驗(yàn)探究ANXA5對HepG2體外遷移、侵襲能力影響;5、與細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞以及小鼠淋巴結(jié)粘附實(shí)驗(yàn)探究ANXA5對HepG2粘附能力影響;6、對微

4、絲進(jìn)行染色，探究ANXA5對HepG2細(xì)胞骨架影響;7、MTT法結(jié)合Hoechst33342染色法檢測ANXA5對HepG2順鉑(cisplatin)耐受性影響;8、Weatern Blot檢測ERK信號通路關(guān)鍵分子、c-Myc表達(dá)變化;9、qRT-PCR檢測E-Cadherin表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:1、構(gòu)建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA5/NC表達(dá)載體，獲得ANXA5表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)單克隆HepG2-shAN

5、XA5及陰性對照HepG2-shNC細(xì)胞株。與HepG2-shNC相比，HepG2-shANXA5中ANXA5下調(diào)近100％;2、HepG2-shANXA5較HepG2-shNC的增殖能力降低，平板克隆形成率降低24.7％;3、與HepG2-shNC相比，HepG2-shANXA5遷移能力降低70.0％;4、HepG2-shANXA5較HepG2-shNC侵襲能力降低85.0％;5、HepG2-shANXA5較HepG2-shNC對細(xì)胞

6、外基質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞、小鼠淋巴結(jié)的粘附能力分別降低10.2％、30.2％、48.0％;6、ANXA5下調(diào)后，HepG2細(xì)胞actin骨架染色變淺，F(xiàn)-actin結(jié)構(gòu)性降低排列紊亂;7、HepG2-shANXA5較HepG2-shNC對cisplatin敏感性明顯降低;8、與HepG2-shNC相比，HepG2-shANXA5中Raf、MEK1/2、ERK2的磷酸化水平降低，c-Myc蛋白水平降低，E-Cadherin mRNA水平升高。