下調miR-155的表達對人A549-DDP細胞株順鉑耐藥性的影響及機制.pdf

1、目的：肺癌已成為全球范圍內發(fā)病率與病死率均居首位的惡性腫瘤?；熓沁M展期非小細胞肺癌重要的治療手段，但是臨床上常常由于癌細胞對藥物耐藥導致化療失敗。近來研究表明非蛋白編碼小分子 RNA(miRNA)能通過基因突變、調節(jié)腫瘤相關靶基因及增殖凋亡相關基因影響肺癌的發(fā)生發(fā)展及藥物的敏感性。miR-155作為miRNA家族中的一種，大量研究也證實其參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與耐藥,但miR-155在肺癌中所擔當?shù)慕巧坝绊懛伟┑南嚓P機制仍存在

2、爭議。本研究通過觀察 miR-155在 A549及其耐藥細胞株 A549/DDP中的表達差異，探究其對肺癌細胞及順鉑敏感性的影響及機制，為耐藥型肺腺癌的個體化治療提供新的思路。
　　方法：⑴細胞培養(yǎng)：人肺腺癌 A549、A549/DDP細胞株在RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清及1%青鏈霉素混合液）中生長，并放于具有適宜條件的細胞培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2，飽和濕度）。⑵耐藥株的鑒定及miR-155及 TP53INP

3、1mRNA表達差異的檢測:MTT法檢測A549/DDP及A549兩個細胞株對順鉑的IC50，計算耐藥倍數(shù)；分別提取兩種細胞的總RNA,并進行質檢,采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測A549/DDP細胞株及A549細胞株中miR-155及 TP53INP1mRNA的表達差異，實驗數(shù)據(jù)采用2-△△Ct進行分析。⑶A549/DDP細胞轉染：將實驗分為抑制劑組（miR155-inhibitor轉染組），空轉染組(NC-inhibito

4、r轉染組)和未轉染組。將FAM標記的miR155抑制物（FAM-miR155-inhibitor）或FAM標記的陰性對照鏈(FAM-NC-inhibitor)和Lipofectamine2000混合后轉染A549/DDP細胞株。⑷指標檢測：qRT-PCR檢測A549/DDP細胞轉染抑制劑前后的miR-155表達情況；qRT-PCR和Western-blot技術檢測A549/DDP細胞轉染前后預測靶基因TP53INP1及其蛋白的表達情況；

5、Western-blot技術檢測A549/DDP細胞轉染前后Bax和Bcl-2蛋白的表達變化；MTT實驗及流式細胞術檢測miR155-inhibitor轉染后A549/DDP對順鉑敏感性、增殖能力及凋亡的變化。⑸統(tǒng)計學分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析。定量資料用均數(shù)±標準差（x±S）表示，多組間比較用單因素方差分析，應用logistic回歸模型計算半數(shù)抑制濃度（50% Inhibitory Concentration，IC50）值

6、，以α=0.05作為檢驗水準。
　　結果：②順鉑對A549和A549/DDP細胞的IC50分別為16.20±2.27μmol/L、69.72±4.83μmol/L，A549/DDP的IC50值是A549的4.3倍，差異具有統(tǒng)計學意義（t=17.36，P=0.001）。②qRT-PCR結果結果顯示miR155在A549/DDP細胞中高表達，約是A549細胞的8.93倍，TP53INP1 mRNA則在其中低表達,差異均具有統(tǒng)計學意義（

7、分別為t=37.30，P=0.001;t=5.418,P=0.006）。③miR-155抑制劑轉染A549/DDP細胞后，qRT-PCR結果顯示A549/DDP細胞株中miR-155的表達量較空載體轉染組下調了57.37%。④qRT-PCR和Western-blot結果顯示，miR-155抑制劑轉染 A549/DDP細胞使miR155表達下調后，其 TP53INP1 mRNA及其蛋白表達水平較空載體轉染組顯著上調，差異均具有統(tǒng)計學意義（

8、P=0.007和P=0.001）。miR155和TP53INP1在肺腺癌細胞中的表達呈負相關。⑤MTT檢測結果表明，miR-155抑制劑轉染A549/DDP細胞后，順鉑對其的IC50值（29.35±3.69μmol/L）明顯高于未轉染組（70.59±3.47μmol/L）和空轉染組（74.18±6.56μmol/L），差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001和P=0.001）。⑥miR-155抑制劑轉染 A549/DDP細胞后，相對于未轉染組

9、和空轉染組，凋亡相關蛋白 Bcl-2表達下調，Bax蛋白表達上調，差異均具有統(tǒng)計學意義（所有P=0.001）。⑦流式細胞術檢測結果表明，miR-155抑制劑轉染A549/DDP細胞后，未轉染組、空轉染組和抑制劑組的早期凋亡率分別為（15.77±2.89）%、（15.58±3.19）%、（32.16±3.59）%；晚期凋亡率分別為（17.33±2.12）%、（18.37±1.73）%、（29.24±2.28）%；總凋亡率分別為（33.1±

10、2.38）%、（33.95±2.31）%、（61.4±2.65）%。抑制劑組的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率與未轉染組和空轉染組相比均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（所有P=0.001）。
　　結論：miR-155高表達于肺腺癌耐順鉑A549/DDP細胞株，參與肺癌順鉑耐藥的產(chǎn)生。下調 A549/DDP細胞株中 miR-155的表達能逆轉其對順鉑的耐藥性、促進凋亡，其機制可能是通過靶向負調控 TP53INP1基因和/或通過其他途徑