酵母PLP合成酶Snz1的結(jié)構(gòu)與催化機理研究及家蠶自噬通路的研究.pdf

1、(Ⅰ)磷酸吡哆醛(PLP)是維生素B6的活性形式，作為多種酶系統(tǒng)的輔酶，在蛋白質(zhì)和糖類的代謝中起著重要作用。迄今為止，已經(jīng)報道的PLP的體內(nèi)合成途徑有兩種，即脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)依賴途徑，和DXP非依賴途徑。DXP依賴的合成途徑主要存在于大腸桿菌和少量真核生物中，由PDX家族編碼的蛋白質(zhì)(PdxA、B、C、F、H、J和GapA)完成，機理目前已經(jīng)研究得非常透徹，PLP的合成前體是赤鮮糖-4-磷酸和1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸。

2、DXP非依賴途徑主要存在于大部分真菌以及植物等真核生物中，參與該合成途徑的蛋白只有兩個：Pdx1和Pdx2，它們以復合物的形式行使功能。其中Pdx2亞基為谷氨酰胺酶，Pdx1則是PLP合成酶。體外生化實驗證明通過這一途徑合成的PLP來源于一個三碳糖和一個五碳糖，最近的研究發(fā)現(xiàn)三碳糖是3-磷酸甘油醛(G3P)或者磷酸二羥戊酮(DHAP)，另一個底物五碳糖則是5-磷酸核糖(R5P)或者5-磷酸核酮糖(RBP)，而不同于DXP依賴途徑的是，P

3、LP骨架上的亞胺基不是來源于谷氨酸，而是由谷氨酰胺經(jīng)水解的銨離子提供。
　　 據(jù)文獻報道，在提供外源氨基的反應體系中，Pdx1可單獨催化PLP合成過程中的一系列反應，包括五碳糖、三碳糖的異構(gòu)、亞胺中間體的生成、氨基加成反應和吡哆環(huán)的形成。在Pdx1催化底物生成PLP的過程中，Pdx1與底物五碳糖之間會生成亞胺中間體，后來在枯草芽孢桿菌中得到驗證，同時鑒定出是由Pdx1的Lys149與RBP形成的中間體。然而海棲熱袍菌Pdxl的結(jié)

4、構(gòu)顯示，RBP與Lys80（枯草芽孢桿菌Pdxl的Lys81），而非Lys149，形成shill堿。為了說明這兩個保守賴氨酸的作用，作者突變了枯草芽孢桿菌的Lys81和Lys149，體外酶活實驗顯示，K81A和K149A均喪失了PLP合成的活性，K80A同時還失去了將R5P異構(gòu)成RBP的能力，但是K149A的異構(gòu)活性反而更高。這些結(jié)果證實，這兩個賴氨酸均對Pdx1的PLP合成活性至關(guān)重要，同時鑒定出了R5P/RBP的異構(gòu)化位點是Lys8

5、1。然而對于三碳糖的結(jié)合位點、異構(gòu)位點以及PLP的加成位點仍然不清楚。
　　 酵母中被鑒定出來的Pdx1同源基因有三個，包括Snzl、Snz2和Snz3，他們均屬于SNZ家族。PDX2同源基因也有三個，分別為SNO1、SN02和SN03，隸屬于SNO基因家族。這兩個家族編碼的蛋白質(zhì)之間存在多種相互作用關(guān)系，其中SNZ2/SN02和SNZ3/SN03參與維生素B1的合成，而SNZ1/SN01則與維生素B6和PLP的合成息息相關(guān)。<

6、br>　　 我們解析了釀酒酵母中Pdxl同源蛋白Snzl(2.30 A)的結(jié)構(gòu)，及Snzl分別與產(chǎn)物PLP(2.20 A)和底物G3P(1.80 A)的復合物結(jié)構(gòu)。在此基礎上，我們對結(jié)合位點的關(guān)鍵氨基酸進行了定點突變，并且通過體外酶活測定實驗進行驗證?；诮Y(jié)構(gòu)分析和體外生化實驗分析，我們鑒定出了三個重要的活性位點，分別是PLP合成位點、G3P結(jié)合位點和G3P中轉(zhuǎn)位點。同時，在所得結(jié)果的基礎上，我們提出了Pdx1/Snzl可能的催化機制

7、，即R5P和DHAP分別在各自的位點發(fā)生異構(gòu)反應，然后被轉(zhuǎn)移到PLP合成位點，并在那里與Pdx2提供的氨基共同生成PLP。
　　 (Ⅱ)細胞編程性死亡(PCD: Programmed Cell Death)是一種進化上高度保守的可調(diào)控的細胞自殺機制，負責清除衰老、無用或者病變的細胞，從而維持有機體的正常生命活動。細胞編程性死亡主要包括兩種形式，即凋亡(Apoptosis)和自噬(Autophagy)，也被分別稱為Ⅰ型和Ⅱ型細胞編

8、程性死亡。自噬作為Ⅱ型細胞程序性死亡，其細胞形態(tài)表現(xiàn)為細胞漿中自噬體的出現(xiàn)、溶酶體的激活和自噬溶酶體的形成。自噬廣泛存在于真核細胞內(nèi)，以溶酶體降解的形式參與細胞內(nèi)物質(zhì)的循環(huán)，特別是絕大多數(shù)長半衰期蛋白質(zhì)的降解。
　　 自噬體的形成依賴于兩個重要的泛素樣結(jié)合通路(ubiquitin-likeconjugation systems)，分別是Atg8-磷脂酰乙醇胺(PE：phosphatidylethanolamine)通路和Atg1

9、2-Atg5-Atg16通路。自噬的調(diào)控則依賴于一些信號轉(zhuǎn)導通路以及蛋白質(zhì)復合體，包括TOR（雷帕霉素受體）信號通路、PI3K-I(磷脂酰肌醇三磷酸激酶Ⅰ)/Akt通路以及PI3K-Ⅲ蛋白復合體。TOR通過激活下游的一系列調(diào)控因子，進而影響相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，起到抑制自噬發(fā)生的作用；PI3K-I/Akt通路的激活可以抑制TSC2的GTP酶活性，使其無法將Rheb-GTP轉(zhuǎn)化為Rheb-GDP，而Rheb-GDP是TOR的負調(diào)控因子，因

10、此PI3K-I/Akt通路通過激活TOR通路發(fā)揮抑制自噬的功能；而同屬于PI3K家族的PI3K-Ⅲ，與其膜受體及Atg6(哺乳動物Beclinl)形成復合物，是自噬的正調(diào)節(jié)因子，尤其在自噬體形成的早期發(fā)揮了重要的作用。
　　 自噬參與調(diào)控了生物體的生長發(fā)育和細胞分化等過程，協(xié)助細胞對抗惡劣環(huán)境的脅迫，同時對防止某些疾病如腫瘤、肌病、神經(jīng)退行性疾病以及在抵御病原微生物的感染和延緩衰老等方面發(fā)揮了重要的作用。此外，自噬還與昆蟲的變態(tài)

11、發(fā)育過程息息相關(guān)。昆蟲從幼蟲到蛹的變態(tài)發(fā)育過程涉及某些原有組織的消退，比如果蠅的唾液腺，家蠶的前胸腺和絲腺組織。絲腺是五齡家蠶體內(nèi)體積最大的組織，包括前部(ASG)、中部(MSG)和后部絲腺(PSG)三個部分。在蛹前期，由蛻皮激素激活的細胞編程性死亡機制促使了絲腺組織的退化和降解。有文獻報道，家蠶的ASG在5齡第一天開始分化，第三天可以觀察到細胞死亡的現(xiàn)象，5齡后期則出現(xiàn)了自噬和凋亡的特征，這些現(xiàn)象說明自噬和凋亡同時參與了絲腺的分化和降

12、解過程，但是二者之間的關(guān)系尚不清楚。不僅僅是在ASG細胞中存在自噬，華南農(nóng)業(yè)大學動物科學院的曹陽教授研究組通過組織切片和電鏡技術(shù)在MSG細胞中也發(fā)現(xiàn)了自噬體和自噬溶酶體結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說明自噬很可能在家蠶絲腺的分化與降解過程中發(fā)揮了非常重要的作用，但是具體的分子機制還不清楚。因此我們通過生物信息學分析找到了家蠶中的自噬相關(guān)蛋白，希望能夠構(gòu)建出家蠶的自噬通路，為將來系統(tǒng)的研究這些蛋白奠定基礎。
　　 我們通過一系列生物信息學分析，利

13、用序列比對的方法在家蠶數(shù)據(jù)SilkDB中找到了20多個自噬相關(guān)基因，并且基于酵母和哺乳動物的自噬機制初步重構(gòu)了家蠶中的自噬通路。這個自噬通路可以進一步劃分為上游的信號轉(zhuǎn)導通路和下游的兩個重要的ubiquitin-like結(jié)合通路。我們通過RT-PCR的方法證實了一些重要的自噬相關(guān)基因在絲腺中的表達，肯定了自噬機制在絲腺組中的作用。此外，為了驗證蛹前期家蠶絲腺中自噬水平的變化，我們針對兩個自噬的標志性基因BmAtg8和BmAtg12，進行